制备酰化肽的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于酰化肽的一个或多个氨基的方法，其中所述酰化反应在含有低于１０％ｗ／ｗ非质子极性溶剂的水性混合物中进行。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于酰化肽和蛋白质的方法。更具体的，本专利技术涉及一种用于将一个或多个酰基导入肽或蛋白质的方法。
技术介绍
业已有大量肽被证实用于医疗实践，所述肽可通过重组DNA技术在适当的宿主细胞中产生，或其可通过现有的肽合成技术合成性制备。但是，天然肽及其类似物倾向于显示高清除率，这对许多临床需要长期高血浆浓度的肽之症状是不可接受的。呈天然形式的具有高清除率的肽的例子有ACTH、促(肾上腺)皮质(激素)释放因子、加压素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、抑胃肽、生长激素释放因子、垂体腺苷酸环化酶激活肽、分泌素、肠抑胃素(enterogastrin)，生长抑素、促生长素、生长介素、甲状旁腺激素、血小板生成素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、后叶加压素、催产素、 阿片及其类似物、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶和核糖核酸酶。已发现肽和肽类似物的多种衍生化用于以有利的方向影响肽的清除速率。一种这样的衍生化是亲脂性酰基向治疗性肽的导入，引起相对于非酰化肽而言所期望之延长的作用曲线。因此，治疗性蛋白质不甚频繁的施用改善了患者对规定治疗的顺应性，且降低了待施用的肽的量。在WO98/08871(其中，尤其是公开了GLP-1及其类似物的酰化)、WO98/08872(其中，尤其是公开了GLP-2及其类似物的酰化)和WO99/43708(其中，尤其是公开了exendin及其类似物的酰化)中业已描述和证实。在肽和酰基之间的单或二肽间隔基，如天冬氨酸和谷氨酸被证实是期望的。包括自由羧酸基的间隔基必须在酰化前被保护，随后去保护。EP1227107公开了人胰岛素ε-氨基的酰化。WO00/55119公开了用于酰化肽(如GLP-1)的方法和新的酰化剂。为了使治疗性肽经济上有益，制备肽的成本以及肽的治疗性剂量非常重要。治疗性肽的制备的主要成本是需要将目标蛋白质与和目标蛋白质紧密相关的杂质(例如异构体，脱氨形式)等分离的纯化步骤。这些纯化步骤通常通过层析进行，提示需要昂贵的层析基质和溶剂以及总产率较低。本专利技术的目的在于提供一种有效、经济的方法，用于通过α-氨基-α，ω-二羧酸间隔基向肽导入亲脂性基团。所述方法更具有特异性，因此有较高的产率且形成较少的密切相关杂质。实现了酰化肽生产成本的明显降低。对于最大化可接受治疗病人的数目以及对于利用通过比皮下注射具有较低生物利用度的其他递送方案(例如经皮和肺递送)的有利性而言，非常希望不甚昂贵的酰化肽。专利技术概述本专利技术提供了一种酰化肽或蛋白质的一个或多个氨基的方法，所述方法包括步骤a)在碱性条件下水性混合物中将具有至少一个自由氨基的肽与通式I的酰化剂反应 其中n是0-8；R1是COOR4；R2是亲脂性部分；R3与R3所连接的羧基一起称为活性酯或活性N-羟基酰亚胺酯；且R4选自氢、C1-12-烷基和苄基；b)如果R4不是氢，在碱性条件下皂化酰化肽的酯基(COOR4)；c)分离N-酰化肽，其特征在于，所述步骤a)中的水性混合物中含有低于10％w/w的非质子极性溶剂。在所述方法的一个实施方案中，所述步骤a)中的反应在含有低于8％w/w，优选低于5％w/w，甚至更优选低于3％w/w的非质子极性溶剂的水性混合物中进行。在所述方法的另一实施方案中，酰化剂作为固体加入反应混合物中。在所述方法的另一实施方案中，酰化剂作为通过加入酸稳定化的非质子性极性溶剂中的溶液加入反应混合物中。专利技术详述肽和蛋白质本专利技术用于向任一肽(或蛋白质)导入亲脂性酰基以降低体内清除率。所述肽和蛋白质的实例有ACTH、促(肾上腺)皮质(激素)释放因子、加压素、降钙素、exendin及其类似物、胰岛素及其类似物、胰高血糖素及其类似物、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)及其类似物、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、抑胃肽、生长激素释放因子、垂体腺苷酸环化酶激活肽、分泌素、肠抑胃素，生长抑素、促生长素、生长介素、甲状旁腺激素、血小板生成素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、后叶加压素、催产素、阿片及其类似物、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶和核糖核酸酶。应当理解肽(或蛋白质)应当带有至少一个自由的氨基，所述氨基是N-末端氨基或侧链氨基。肽或蛋白质可含有不是由遗传密码编码的氨基酸，如D-氨基酸、3-羟基脯氨酸、鸟氨酸和戊基甘氨酸。特别感兴趣的是赖氨酸和鸟氨酸氨基酸残基的氨基。本专利技术的方法特别与赖氨酸残基ε-氨基的N-酰化相关。也应当理解目标肽或蛋白质可含有两个或多个侧基氨基，其均可根据本专利技术被N-酰化。本专利技术特别适于GLP-1及其类似物的酰化。可被根据本专利技术N-酰化的GLP-1及其类似物的实例是GLP-1和截短的类似物，如Arg26-GLP-1(7-37)；Arg34-GLP-1(7-37)；Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26Lys39-GLP-1(7-39)；Arg34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34-GLP-1(7-37)；Gly8Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-37)；Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Val8Arg22-GLP-1(7-37)；Met8Arg22-GLP-1(7-37)；Gly8His22-GLP-1(7-37)；Val8His22-GLP-1(7-37)；Met8His22-GLP-1(7-37)；His37-GLP-1(7-37)；Gly8-GLP-1(7-37)；Val8-GLP-1(7-37)；Met8-GLP-1(7-37)；Gly8Asp22-GLP-1(7-37)；Val8Asp22-GLP-1(7-37)；Met8Asp22-GLP-1(7-37)；Gly8Glu22-GLP-1(7-37)；Val8Glu22-GLP-1(7-37)；Met8Glu22-GLp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备Ｎ－酰化肽的方法，所述方法包括下列步骤：ａ）在碱性条件下于水性混合物中将具有至少一个自由氨基的肽与通式Ⅰ的酰化剂反应＊＊＊其中ｎ是０－８；Ｒ↑［１］是ＣＯＯＲ↑［４］；Ｒ↑［２］是亲脂 性部分；Ｒ↑［３］与Ｒ↑［３］所连接的羧基一起被称为活性酯或活性Ｎ－羟基酰亚胺酯；且Ｒ↑［４］选自氢、Ｃ↓［１－１２］－烷基和苄基；ｂ）如果Ｒ↑［４］不是氢，在碱性条件下皂化酰化肽的酯基（ＣＯＯＲ↑［４］）； ｃ）分离Ｎ－酰化肽，其特征在于，所述步骤ａ）中的水性混合物中含有低于１０％ｗ／ｗ的非质子极性溶剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DL丁韦伯，IH延森，LB汉森，
申请(专利权)人：诺沃娜第克公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]