一种醛基修饰的蛋白质芯片基片及其制作方法技术

本发明专利技术涉及一种醛基修饰的蛋白质芯片基片及其制作方法，其特征在于以普通玻璃基片或硅片作为载体，将活性官能基团醛基引入基片表面，生成能够有效牢固固定蛋白质的蛋白质芯片基片。其置备方法主要包括羟基化、ＡＰＴＥＳ的自组装和对苯二甲醛的组装三步。对苯二甲醛中的两个醛基中的一个和基片表面的氨基基团发生反应并以Ｃ＝Ｎ双键结合，另外的活性醛基暴露在芯片表面，可以和蛋白质的氨基基团发生反应，生成Ｃ＝Ｎ双键，将蛋白质固定在玻璃或硅片表面上，本发明专利技术的优点是以价格较低的玻璃片和硅片作为蛋白质芯片的载体，降低了生产的成本；通过共价键将蛋白质固定在玻璃片或硅片表面，在蛋白质相互作用过程中不易脱落。制备方法简单，性能稳定，可大规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，这种醛基修饰的蛋白质芯片基片可以将蛋白质通过共价键固定在芯片表面。
技术介绍
现在的蛋白质芯片是指在固相支持物(载体)表面固定大量蛋白探针(可以是抗原、抗体，受体、配体、酶、底物等)，形成高密度排列的蛋白质点阵。利用这种芯片和含有未知蛋白质的液体(体液或细胞和组织提取物)进行孵育反应，反应后用相应的检测系统进行检测，最后应用计算机分析和比较相应检测蛋白质的表达情况。蛋白质芯片根据相互作用原理可分为抗原-抗体芯片，受体-配体芯片，酶-底物芯片和多肽芯片等。蛋白质芯片的制作比DNA芯片的制作更为复杂，蛋白质很难在载体表面合成，合成的序列也很短，而且合成多肽序列的空间结构很难预测，因而目前蛋白质芯片多采用在基片表面直接点样的方法。其中重要的一个步骤是如何将这些点样的蛋白质固定在芯片表面。由于蛋白质种类繁多、性质各异，而载体表面只能用一种化学或生物基团修饰，这给探针与载体表面基团的结合带来困难。这是制备蛋白质芯片过程中首先要解决的问题。有多种不同的方法和标签(Tag一种短的化合物链)用于蛋白质在固相支持物表面的固定。如非共价键的吸附以及共价键结合，用链亲和素的亲和捕获((1)Hoyer-Hansen G，Hamers M J，Pedersen A N，et al.Loss of ELISAspecificity due to biotinylation of monoclonal antibodies.J.Immunol.Methods 2000，235(1-2)91-9；(2)Rowe C A，Tender L M，Feldstein M J，et al.Array biosensor for simultaneous identification of bacterial，viral，and proteinanalytes.Anal.Chem.1999，71，3846-3852)。这些蛋白质固定技术各有优缺点，非共价键的吸附具有高吸附容量，较好地保持蛋白质的空间结构，较低的非特异性吸附等优点，但是物理的非共价吸附无法控制蛋白质吸附的数量以及蛋白质吸附的方向性，因而芯片的反应效率、反应的准确性和反应的重现性等方面都受到影响。共价键的结合是在载体表面衍生活泼的化学基团，如醛基、环氧基、氨基、活化酯((3)MacBeath G，Schreiber S L.Printing proteins as microarrays forhigh-throughput function determination.Science 2000，289，1760-1763.(4)Ziauddin M，Sabatini D M.Microarrays of cell expressing defined cDNAs.Nature 2001，411，107-110.)。以及镍-氮川三乙酸钠螯合物((5)Templin M F，Stoll D，Schrenk M，et al.Protein microarray technology.Trends Biotechnol2002，20160-166)等，用来固定蛋白质。短链两端各有一个功能基团的硅烷可以用于蛋白质分子在固相表面的固定，它的一个功能基团可以和玻璃表面的羟基反应，而另外一个功能基团(醛基或环氧基)可与蛋白质的氨基反应，还可以对该功能基团进一步化学修饰以达到反应的特异性。但是环氧基修饰基片过程较为复杂，固定效率不高，氨基修饰基片虽较为简单，但结合固定效果不理想。制作蛋白质芯片首先要选择合适的基片作为蛋白质的载体，蛋白质芯片的载体要满足一下几个方面的要求1)基片要能够适合高密度点样的要求；2)固定的蛋白质在杂交、洗脱和分析过程中不易脱落；3)不同批次基片之间以及同一基片各点之间均一性好；4)分析复杂蛋白质混合物时有较好的信噪比；5)蛋白质探针有较好的保质期；6)探针固定后能够保持蛋白质的活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，它是一种在玻璃片或硅片表面进行醛基修饰，用来固定蛋白质，制作成的蛋白质芯片基片。本专利技术解决的关键问题是如何对玻璃基片或硅基片进行一系列的化学表面处理，将活性的官能基团醛基引入到基片表面，提供一种供够有效而牢固地固定蛋白质的芯片或硅片基片。该蛋白质芯片基片及其制备方法具有材料来源丰富、成本低廉，制作方法和流程简单、蛋白质固定牢固，固定效率高等特点，适合大规模蛋白质芯片基片的生产。本专利技术所述的一种醛基修饰的蛋白质芯片基片的制作方法，包括羟基化、3-氨丙基-3乙氧基硅烷的组装和对苯二甲醛的组装三步，具体步骤是(1)首先用浓度为98％的H2SO4和30％的H2O2按体积比为7∶3的比例配制的洗液浸泡进行表面处理，使基片羟基化；(2)将步骤(1)羟基化的基片清洗吹干后，在3-氨丙基-3乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中组装；形成一层末端为氨基的单分子自组装膜；(3)组装后基片经漂洗和吹干，在烘箱中烘烤，使3-氨丙基-3乙氧基硅烷完全(APTES)与芯片组装；(4)将步骤组装后的基片，再在对苯二甲醛溶液中组装；表面形成活性醛基；(5)取出漂洗，吹干，避光保存。所述的基片为普通的玻璃基片或硅片，清洗是超声波清洗，然后用去离子水清洗。在上述步骤(2)组装用的3-氨丙基-3乙氧基硅烷的无水乙醇溶液浓度为10-15mmol/L，组装时间为30-45分钟。在上述步骤(1)中所述的羟基化的基片是先用去离子水清洗，并用氮气吹干。在上述步骤(3)中所述的烘箱烘烤温度为100-110℃，时间为45分钟。在上述步骤(3)所述的组装后漂洗是用无水乙醇在摇床中漂洗，再用氮气吹干的；步骤(5)所述的组装后漂洗是用去离子水在摇床中漂洗，再用氮气吹干。在上述步骤(4)所述对苯二甲醛溶液中组装，其溶液浓度为10-15mmol/L，组装时间为45-60分钟。本专利技术所制作的醛基修饰的蛋白质芯片基片，其特征在于基片表面具有高密度的活性醛基，蛋白质固定在基片表面。所述的高密度活性醛基，由于对苯二甲醛为刚性分子，不可任意扭曲，其分子中两个醛基只能有一个与基片表面上的氨基反应并以C＝N双键结合，另一个暴露在基片表面，和蛋白质的氨基基团发生反应，生成C＝N双键，将蛋白质固定在玻璃或硅片表面上。所述的醛基修饰芯片基片的质量评价方法芯片基片的质量主要通过检测基片的荧光背景、固定效率赫里斯系数三个参数进行评价的。荧光背景是一个数值，指芯片基片用共聚焦扫描仪在一定扫描强度下进行扫描所得的平均荧光信号强度。为了不影响在使用过程中对荧光信号的判读，荧光背景信号应尽可能较低。固定率是芯片基片经点样固定后，洗涤液洗涤后荧光信号强度与洗涤前荧光信号强度的百分比，它反映了点样区蛋白质的固定效率。离散系数是固定率标准差S与固定率均数F之比，用百分数表示，其大小反映基片的均一性，离散系数越小，说明基片的均一性越好。本专利技术旨在阐述芯片基片荧光背景和固定率的检测方法，FITC标记的IgG在醛基修饰芯片基片上的固定方法，同时给出按实施例1、2、3制备的醛基修饰蛋白质芯片的相应检测结果。(详见表1) (1)荧光背景的检测将蛋白质芯片插入扫描仪Genepix 4000B，采用532nm波长检测，在PMT为750，激光强度为10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种醛基修饰的蛋白质芯片基片的制作方法，其特征在于包括羟基化、３－氨丙基－３乙氧基硅烷的组装和对苯二甲醛的组装三步，具体步骤是：（１）首先用浓度为９８％的Ｈ↓［２］ＳＯ↓［４］和３０％的Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］按体积比为７∶３的比例配制 的洗液浸泡进行表面处理，使基片羟基化；（２）将步骤（１）羟基化的基片清洗吹干后，在３－氨丙基－３乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中组装；形成一层末端为氨基的单分子自组装膜；（３）组装后基片经漂洗和吹干，在烘箱中烘烤，使３－氨丙基－３ 乙氧基硅烷完全与芯片组装；（４）将步骤组装后的基片，再在对苯二甲醛溶液中组装；表面形成活性醛基；（５）取出漂洗，吹干，避光保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨梦苏，刘康栋，金庆辉，韩智勇，赵建龙，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]