一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域。本发明专利技术提供了一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10。本发明专利技术的sgRNA分值高、脱靶效率低，指导Cas9酶切靶标序列效率高。可以对CsPP2B15基因进行修饰和表达调控，其突变的CsPP2B15基因显著增加了转基因柑橘对黄龙病的抗性，黄龙病症状明显减缓，病原菌含量显著下降。

【技术实现步骤摘要】
一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法
本专利技术涉及植物基因工程
，尤其涉及一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法。
技术介绍
柑橘黄龙病是一种系统性的病害，所造成的危害是毁灭性的，并且病菌几乎能侵染所有柑橘品种。据统计，柑桔黄龙病已在我国19省区蔓延，受害面积占柑桔总栽培面积的80％以上，产量占总产量的85％左右。柑桔黄龙病病原为韧皮部杆菌属革兰氏阴性细菌，包括亚洲种、非洲种和南美洲种。目前，柑橘生产上尚无从根本上解决柑橘黄龙病病害的技术措施，只能采取销毁发病植株或发病果园等一系列破坏性措施，来彻底清除柑橘黄龙病。对果农来说，经济损失非常严重。由于柑橘黄龙病问题采用传统手段无法完全解决，因此需要寻找更好的方法。利用抗性种质资源，结合植物基因工程手段挖掘抗病基因，并培育抗病品种增强柑橘对黄龙病的抗性，是最为经济，同时也是从根本上解决这一难题的最为有效的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法，从根本上解决黄龙病的威胁，彻底清除柑橘黄龙病。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种改良柑橘的sgRNA，其核苷酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9或SEQIDNo.10。作为优选，所述sgRNA序列在改良柑橘时作用于柑橘CsPP2B15基因。本申请还提供了一种改良柑橘的sgRNA在改良柑橘黄龙病抗性中的应用。本申请还提供了一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，包括如下步骤：(1)利用sgRNA序列构建CRISPR/Cas9编辑用表达载体；(2)将步骤(1)构建的表达载体导入到柑橘中，筛选出转基因植株；(3)从步骤(2)获得的转基因植株中筛选出CsPP2B15突变体植株；(4)从步骤(3)获得的CsPP2B15突变体植株中筛选出柑橘黄龙病抗性植株。作为优选，所述步骤(1)中构建载体时所用的载体为pCas9-CsPP2B15sgRNA。作为优选，所述步骤(1)中构建载体时所用的酶为BamHI/SalI酶。作为优选，所述导入的方法为根癌农杆菌介导法和电击转化法。作为优选，所述步骤(2)中所述的转基因柑橘植株筛选方法为抗性筛选、GUS组织化学染色和PCR验证。作为优选，所述步骤(3)中筛选突变体植株的方法为Sanger测序法和重测序技术。作为优选，所述步骤(4)中黄龙病抗性植株筛选方法为嫁接传毒、温室症状和切片观察、定量PCR检测。本专利技术提供了一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9或SEQIDNo.10。本专利技术的sgRNA分值高、脱靶效率低，指导Cas9酶切靶标序列效率高。可以对CsPP2B15基因进行修饰和表达调控，其突变的CsPP2B15基因显著增加了转基因柑橘对黄龙病的抗性，黄龙病症状明显减缓，病原菌含量显著下降。附图说明图1为sgRNA活性体外检测的电泳图；图2为pGN-CsPP2B15植物表达载体T-DNA结构示意图；图3为pCas9-PP2B15sgRNA载体T-DNA结构示意图；图4为OEPP2B5转基因植株PCR检测和植株表型图；图5为Cas9转基因植株的PCR鉴定结果图；图6为plGN-CsPP2B15转基因株系中CsPP2B15基因的表达水平；图7为Cas9介导的CsPP2B15编辑情况测序分析；图8为超量表达CsPP2B15的转基因柑橘感病后6个月症状情况；图9为超量表达CsPP2B15的转基因柑橘感病后第6个月和12个月病原菌含量的qPCR分析；图10为突变体的转基因柑橘感病后6个月症状情况；图11为突变体的转基因柑橘感病后第6个月和12个月病原菌含量的qPCR分析。具体实施方式在本专利技术中，未做具体说明的试剂药品均为普通市售,材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例1DNA的提取选取柑橘叶脉0.1～1g，使用Aidlab公司试剂盒(cat.No.DN15)提取柑橘基因组DNA，提取出的DNA于-20℃保存，备用。实施例2RNA的提取及cDNA的合成选取柑桔叶叶脉0.1g用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab，cat.No.RN09)提取叶片总RNA，用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。cDNA第一链的合成按照BIO-RADiScriptTMcDNASynthesisKit(BIO-RAD，cat.No.170-8891)说明书进行。合成的cDNA于-20保存，备用。实施例3基因组序列的PCR扩增(1)25μL的扩增体系为：(2)扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。实施例4DNA片段的回收、连接以及大肠杆菌DH5α的转化在紫外灯下，用洁净的刀片切下实施例2中的含目的片段的琼脂糖凝胶块，胶回收方法参照试剂盒(购自Omega公司)的使用说明书进行。回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。酶切体系的建立和反应条件均参考TaKaRa公司限制性内切酶试剂盒的说明书进行。酶切回收的片段，或者扩增获得的回收片段按连接酶试剂盒说明书克隆到pGEM-T/pGEM-TEasy(Promega)载体上。连接反应体系如下：反应体系中载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比＝1:3；16℃连接1h，之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，37℃培养。实施例5CsPP2B15基因的克隆CsPP2B15序列从华中农大甜橙基因组数据库CAP(http://citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/orange/)中获得(Xu,etal.,2013)，GeneIDCs3g14680.1。根据基因序列设计CsPP2B15基因引物SEQIDNo.11和SEQIDNo.12，分别以感染黄龙病柑橘叶脉cDNA和DNA为模板，PCR扩增CsPP2B15的编码序列CDS(SEQIDNo.13)和基因组序列(SEQIDNo.14)。回收PCR产物，连接pGEM-Teasy载体并转化大肠杆菌E.coliDH5α。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改良柑橘的sgRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9或SEQ ID No.10。/n

【技术特征摘要】
1.一种改良柑橘的sgRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9或SEQIDNo.10。


2.根据权利要求1所述的一种改良柑橘的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA序列在改良柑橘时作用于柑橘CsPP2B15基因。


3.权利要求1所述的一种改良柑橘的sgRNA在改良柑橘黄龙病抗性中的应用。


4.权利要求1所述的一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用sgRNA序列构建CRISPR/Cas9编辑用表达载体；
(2)将步骤(1)构建的表达载体导入到柑橘中，筛选出转基因植株；
(3)从步骤(2)获得的转基因植株中筛选出CsPP2B15突变体植株；
(4)从步骤(3)获得的CsPP2B15突变体植株中筛选出柑橘黄龙病抗性植株。


5.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹修平，文庆利，龙俊宏，刘语诺，龙琴，何永睿，彭爱红，陈善春，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50