本发明专利技术公开一种血清或血浆样品稀释液，用在夹心ＥＬＩＳＡ检测人脂肪细胞补体相关蛋白（Ａｃｒｐ３０）中稀释血清（血浆）样品，它包括一种还原剂及缓冲组分，具体可以由２５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ｐＨ８．０的Ｔｒｉｓ缓冲液、２ｍＭ ｐＨ８．０的ＥＤＴＡ、和２００ｍＭ ＮａＣｌ组成。使用本发明专利技术稀释液可以使样品处理、稀释、上样一次完成，并且使得待检样品稀释前后无须煮沸处理，操作简便，并通过改变反应条件，缩短了反应时间，实现了对人血清（血浆）Ａｃｒｐ３０蛋白快速定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶联免疫吸附测定(ELISA)中，血清或血浆样品的处理、稀释、上样，特别应用于夹心ELISA检测人血清(血浆)中脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)的含量。
技术介绍
目前，大部分ELISA系统中的包被、酶标抗体是用重组表达蛋白作为抗原，免疫动物产生的。若重组蛋白大量表达，形成包涵体沉淀，须使用变性剂将其完全变性溶解后再免疫动物。而变性蛋白与天然蛋白的构象有一定差别，其免疫动物产生的抗体可能很难与天然蛋白结合，从而影响ELISA建立。Acrp30是脂肪细胞特异性分泌的血浆蛋白，1995年，Scherer等首先报道了Acrp30的存在及其cDNA序列。人Acrp30基因位于3q27，其编码蛋白含有247个氨基酸，单体分子由4个结构域组成，从N端到C端依次为信号肽序列、非同源序列、胶原样结构域、球状结构域，C端球状区(110～247氨基酸)占主要部分。Acrp30翻译后可发生糖基化，是一种糖蛋白，其球状区三聚体结构与肿瘤坏死因子(TNF)家族具有极强的同源性。Acrp30在血浆中有两种形态，即低分子量同源三聚体(LMW)和高分子量复合体(HMW)。Acrp30寡聚体通过39位半胱氨酸(Cys-39)上的二硫键连接，Cys-39突变造成胶原区蛋白剪切形成三聚体。最近Tsao等的研究表明循环血液中大部分Acrp30(＞80％)是以HMW形式存在，少部分为六聚体(＜10％)和三聚体(＜10％)。Acrp30的生理学功能包括调节糖、脂代谢，提高胰岛素敏感性，抗动脉粥样硬化等。新近的研究表明Acrp30有抗炎保肝的效果，有可能成为一种新的肝病治疗药物。目前，人血清(血浆)中脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)的含量测定，使用的ELISA试剂(Linco Research，Inc.等)仅供实验室研究使用，且检测周期长，操作较复杂；国内尚无成套试剂。在用鼠抗人Acrp30单抗作包被，兔抗人Acrp30多抗作酶标，用于免疫动物的重组蛋白Acrp30是以包涵体形式表达，在免疫前用8M尿素使其变性溶解的实验设计中，采用现有ELISA试剂中的样品稀释液配方，均不能检测到人血中的Acrp30，因而有必要寻找一种适合的样品稀释液。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于酶联免疫吸附测定中的针对血清或血浆样品的稀释液。本专利技术提供的样品稀释液，用于酶联免疫吸附测定中，它包括一种还原剂及缓冲组分。其中，所述还原剂为二硫苏糖醇，代号DTT，DTT的浓度在5mM到500mM，优选为20mM到100mM，最好为25mM。其中，所述缓冲组分为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、和NaCl的组合。其中pH8.0的Tris缓冲液浓度在50mM到200mM，pH8.0的EDTA浓度在1mM到5mM，NaCl的浓度在100mM到400mM。本专利技术样品稀释液配方最好为25mM DTT、100mM pH8.0的Tris缓冲液、2mMpH8.0的EDTA、和200mM NaCl。本专利技术的另一目的在于提供一种夹心法ELISA检测人血清或血浆脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)含量的方法。本专利技术提供的一种夹心法ELISA检测人血清或血浆脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)含量的方法，是使用前面所述的任一种血清或血浆样品稀释液来稀释待测样品。该方法具体步骤包括步骤一.包被酶联板每孔加100微升用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液1∶2000稀释的鼠抗人Acrp30单克隆抗体，室温孵育过夜；然后弃去液体，用pH7.4的0.01M PBST洗板2次，拍干板子；每孔加150微升用1.5％牛血清白蛋白、4％饱和硫酸铵、5％蔗糖、5％EDTA、0.01M PBS和0.2‰柳硫汞组成的封闭液，室温孵育1小时；然后弃去液体，拍干板子；步骤二.检测步骤用未加DTT的样品稀释液作为标准品稀释液，对标准品作1∶50稀释后，再作倍比稀释至1∶1600；在离心管里加100微升样品稀释液，再加25微升人血清或血浆浆标本，该标本为经5000g离心1分钟后取的上清液；每孔加100微升稀释好的标准品、人血标本，37℃震摇孵育40分钟；弃去液体，用pH7.4的0.01MPBST洗板5次，拍干板子；每孔加100微升用酶标稀释液1∶300稀释的酶标抗体，37℃震摇孵育30分钟，其中该酶标稀释液由20％小牛血清、15％甘油、4％聚乙二醇6000、0.75％饱和硫酸铵、0.01M PBS和0.1％吐温-20组成，该酶标抗体为用过碘酸钠法标记上辣根过氧化物酶的兔抗人Acrp30多克隆抗体；弃去液体，用0.01M PBST(pH7.4)洗板5次，拍干板子；然后每孔加A、B显色液各一滴，37℃震摇孵育15分钟，其中A显色液为十二水磷酸氢二钠18.41g/L、柠檬酸7.65g/L和30％双氧水0.24ml/L组成，B显色液为四甲基联苯胺0.4g/L、二甲基甲酰胺40ml/L、EDTA0.525g/L和柠檬酸4.2g/L组成；然后每孔加50微升1M硫酸终止液，OD450nm检测；步骤三.根据标准曲线，得到检测样品中人血Acrp30含量。依照上述技术方案，本专利技术因提出含还原剂的样品稀释液，使得待检样品稀释前后无须煮沸处理，操作简便，并通过改变反应条件，缩短了反应时间，实现了对人血清(血浆)Acrp30蛋白快速定量检测。附图说明图1为本专利技术中菌产Acrp30标准品的稀释示意图；图2为本专利技术中ELISA检测菌产Acrp30的标准曲线图。具体实施例方式本专利技术涉及酶联免疫吸附测定(ELISA)中，血清或血浆样品的处理、稀释、上样。在本专利技术涉及的研究中，用鼠抗人Acrp30单抗作包被，兔抗人Acrp30多抗作酶标，用于免疫动物的重组蛋白Acrp30是以包涵体形式表达，在免疫前用8M尿素使其变性溶解。该实验设计中，需要检测人血中的Acrp30含量，发现其中样品稀释液会影响Acrp30的检测。为此，经艰苦摸索与实验，本专利技术提出了一种血清或血浆样品稀释液。本专利技术提出的稀释液的主要特点是含有还原剂，实验结果显示，还原剂为二硫苏糖醇(DTT)为最好，使用浓度在20mM到100mM时效果较好，最佳浓度约为25mM。本专利技术样品稀释液中还包括缓冲液成分，为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、和NaCl的组合。其中，Tris缓冲液(pH8.0)的浓度大约在50mM到200mM，最佳浓度约为100mM；EDTA(pH8.0)的浓度大约在1mM到5mM，最佳浓度约为2mM；NaCl的浓度大约在100mM到400mM，最佳浓度约为200mM。实施例一本专利技术血清(血浆)样品稀释液的配制本专利技术最优选的血清(血浆)样品稀释液，为25mM DTT、100mM Tris缓冲液(pH8.0)、2mM EDTA(pH8.0)、200mM NaCl组成，参见表1。表1样品稀释液成份 表1中所列组分，分别按下面方式配制待用Tris称24.22g，加蒸馏水至100ml，配制浓度为2M；HCl取11.6N的HCl 172.4ml，加蒸馏水至1000ml，配制浓度为2M；Tris缓冲液(pH8.0)2M Tris 50ml加2M HCl 29.2ml，加蒸馏水至本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种血清或血浆样品稀释液，用于酶联免疫吸附测定中，其特征在于，它包括一种还原剂及缓冲组分。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈竞新，王全立，詹林盛，王会中，付秋霞，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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