一种定量检测诺氏海链藻的方法技术

公开了一种检测待测样品中诺氏海链藻数量的免疫学方法，包括步骤：（ａ）使固定有诺氏海链藻细胞裂解碎片的固相载体同时与待测样品以及抗诺氏海链藻抗体接触；（ｂ）将固相载体与待测样品和抗诺氏海链藻抗体分开；（ｃ）检测与固相载体结合的抗诺氏海链藻抗体的量，所述固定在固相载体上的诺氏海链藻细胞裂解碎片与待测样品中的诺氏海链藻细胞竞争结合抗诺氏海链藻抗体，而且存在于所述待测样品中的诺氏海链藻细胞数目是根据抗诺氏海链藻抗体与固定在固相载体上的诺氏海链藻细胞裂解碎片结合或不结合的相对程度测定的。还公开了用于该检测方法的试剂盒及其用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于利用免疫学方法检测海洋环境中微型生物的
具体地说，本专利技术涉及通过竞争性抗原抗体结合抑制检测诺氏海链藻的方法和试剂盒，及其用于检测诺氏海链藻的用途。
技术介绍
诺氏海链藻(Thalassiosira nordenskioeldi)是一种在世界范围内广泛存在的浮游植物，也是我国近海常见的硅藻优势种之一。本种是我国近海常见的赤潮生物，曾经有多次引发赤潮的报道，给海洋渔业和人类健康带来巨大威胁。因此，及时、准确、快速地检测诺氏海链藻，随时了解其在海洋中的动态变化具有重要意义。在分类学上，诺氏海链藻属于硅藻门海链藻属。传统的鉴别方法，即从形态学上区分诺氏海链藻，主要是利用光学显微镜直接观察和计数，操作时存在一定困难，且过程烦琐，费时、费力，当样品量多时工作量极大，主要用于藻的定性和分离，而不适用于藻的定量研究。因此，发展用于快速检测诺氏海链藻的新方法和新技术极具现实意义。但是，目前国内国际关于这方面的研究进展不大，尚未形成非常有效的对藻类进行定性和定量测定的成熟技术。基于抗体技术的竞争性ELISA方法具有特异、灵敏、高效、易操作、造价低廉等优点，且能同时分析大量的样本，是一种对目标抗原进行定性定量分析的有效手段。目前，竞争性ELISA方法主要在医学检测和微生物学检测研究中应用，尚未用于对整个藻细胞进行检测的报道。另外，虽然藻细胞抗体的制备过程简单，但不易获得高特异性的抗体。因此，本领域迫切的需要一种快速检测诺氏海链藻的方法。
技术实现思路
因此，在本专利技术的第一个方面，公开了一种检测待测样品中诺氏海链藻数量的免疫学方法，包括步骤(a)使固定有诺氏海链藻细胞裂解碎片的固相载体同时与待测样品以及抗诺氏海链藻抗体接触；(b)将固相载体与待测样品和抗诺氏海链藻抗体分开；(c)检测与固相载体结合的抗诺氏海链藻抗体的量，所述固定在固相载体上的诺氏海链藻细胞裂解碎片与待测样品中的诺氏海链藻细胞竞争结合抗诺氏海链藻抗体，而且存在于所述待测样品中的诺氏海链藻细胞数目是根据抗诺氏海链藻抗体与固定在固相载体上的诺氏海链藻细胞裂解碎片结合或不结合的相对程度测定的。在该方面的一个优选实施方式中，抗诺氏海链藻抗体是多克隆或单克隆抗体。更优选的，多克隆抗体是通过用诺氏海链藻细胞、细胞裂解物或细胞分离组分免疫动物制备的，优选动物选自兔、鼠、豚鼠、鸡、羊、牛、马、狗、猪。在该方面的另一个优选实施方式中，诺氏海链藻细胞裂解碎片以106-107细胞/毫升的浓度固定在固相载体上。在该方面的另一个优选实施方式中，步骤(c)的检测是通过抗诺氏海链藻多克隆抗体的二抗，其中二抗与标记物偶联。优选标记物选自放射性同位素、生物素、酶、荧光素或化学发光物质。更优选的酶是辣根过氧化物酶。在该方面的还有一个优选实施方式中，固相载体是酶标板。在本专利技术的第二个方面，公开了一种试剂盒，含有(a)固定有诺氏海链藻细胞裂解碎片的固相载体；(b)抗诺氏海链藻细胞的抗体；和(c)偶联有标记物的二抗，针对抗诺氏海链藻细胞抗体。在本专利技术的第三个方面，公开了上述试剂盒的用途，用于检测诺氏海链藻细胞。附图说明图1显示了抗诺氏海链藻抗血清效价测定曲线，分别用不同稀释比例稀释的包被物包被酶标板，经过常规ELISA步骤后分别获得的结果。图2显示了实施例3中用已知浓度的系列稀释的诺氏海链藻定标绘制的标准曲线。图3显示了实施例3中根据图2的标准曲线绘制的直线方程。具体实施例方式本专利技术的目的是提供诺氏海链藻免疫学检测的方法，它可以客观、准确地对该藻进行检测。具体包括本专利技术提供的检测方法，即竞争性间接ELISA法，以专一性地识别诺氏海链藻的抗体作为基础。抗体的产生本专利技术所述的抗体可以经由诺氏海链藻免疫实验动物而获得，这些实验动物是本领域技术人员所熟知的，通常包括(但不局限于)兔、鼠、猪、狗、牛、羊、马等。特异性的抗体可以直接使用，另一方面抗体的特异性可以经由一些常规的手段，如抗体封闭技术等，得到提高，这也是为本领域内技术人员熟知的，另外，抗体本身也可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记而进行使用。本专利技术所述的抗诺氏海链藻抗体具有较好的种特异性。利用竞争ELISA测定所述的抗体与其它藻之间的交叉反应率，结果表明它只能识别诺氏海链藻而不识别其它藻，故可用于诺氏海链藻的定性鉴别。本专利技术所述的二抗可以经由直接购买通用的二抗或由一种动物的IgG免疫另一种实验动物而获得，这一技术是本领域技术人员所熟知的。与二抗偶联的标记物可以是一直接可检测基团，如金属溶胶(如金溶胶)、发色团或荧光团(如花青、酞菁、部花青、三苯基甲基、马菁)等的结合位点，见应用化学论题，红外吸收发色团、M.Matsuoka编，Plenum Press，New York，NY，1990，应用化学论题，染料的化学和应用，Waring等，Plenum Press，New York，NY，1990，和荧光探针和研究化学手册，Haugland，Molecular Probes，Inc.1996，和放射性标记、酶、磁性颗粒，浊度诱导剂等的结合位点，或它可已携带这样的可直接检测的基团。酶联免疫检测技术酶联免疫检测技术具有灵敏度高(可百倍于常规检测技术)、操作简便、步骤可控、高效快速等优点，且能同时分析大量的样本，是一种对目标抗原进行定量分析的有效手段。标准曲线的确定(1)以诺氏海链藻细胞裂解液包被酶标板，过夜后用BSA溶液封闭，孵育后洗板，加入已知数量的诺氏海链藻悬浮液，加入诺氏海链藻的抗体稀释液，孵育后洗板，加入酶标二抗溶液，孵育，洗板后加入酶反应底物，孵育后加入终止液终止反应；(2)用酶标仪测定板上各孔的吸光值，经过数据转换后，得出诺氏海链藻定量检测的标准曲线，其线形范围经过计算得出直线方程，根据得到的方程对待测样品中的诺氏海链藻进行定量。用酶标仪测定板上各孔的吸光值，然后计算出相应的抑制率％，计算公式为A/A0×100％，其中A0为最大值，即加入的已知浓度的藻细胞系列梯度稀释液中，藻细胞数为0时的吸光值；A为其它各孔的吸光值，接着计算出各孔抑制率的自然对数值，以之为纵坐标，以藻细胞系列梯度稀释液中藻细胞数目的常用对数值为横坐标，绘制出诺氏海链藻定量检测的标准曲线，找出其线性范围并计算出抑制率的自然对数值和对应的藻细胞数目常用对数值的直线相关方程，线性相关系数必须在0.99以上。本专利技术的最主要理论基础是特异性的抗体可以专一地识别特定的抗原决定簇，因而可对抗原进行定性和定量检测。该方法的基本原理如下一定量的藻细胞经破碎后，裂解物包被于固相载体上(如酶标板等)，经封闭后，同时加入抗体和竞争抗原(即含有目标藻的标准品或待检测样品)，这样，固相上的藻细胞和液相中的藻细胞就会竞争结合抗体，通过检测固相上竞争到的抗体量即可算出相应的竞争样本中的藻细胞含量，因此可准确地对未知样品进行定量测定。这种分析方法不仅克服了诺氏海链藻常规检测中的缺点，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。本专利技术首次提供了快速、简便、大批量定量检测该藻的方法，使监测某海区或养殖场内海水中诺氏海链藻的动态变化成为可能。通过监测到的动态数据，可以掌握海水污染状况，并即时做出调整以减少经济损失；同时，将这些动态数据与其他数据(诸如营养盐、其他本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测待测样品中诺氏海链藻数量的免疫学方法，其特征在于，该方法包括步骤：（ａ）使固定有诺氏海链藻细胞裂解碎片的固相载体同时与待测样品以及抗诺氏海链藻抗体接触；（ｂ）将固相载体与待测样品和抗诺氏海链藻抗体分开；（ｃ）检测与固相载体结合的抗诺氏海链藻抗体的量，所述固定在固相载体上的诺氏海链藻细胞裂解碎片与待测样品中的诺氏海链藻细胞竞争结合抗诺氏海链藻抗体，而且存在于所述待测样品中的诺氏海链藻细胞数目是根据抗诺氏海链藻抗体与固定在固相载体上的诺氏海链藻细胞裂解碎片结合或不结合的相对程度测定的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于志刚，李荣秀，辛泽毓，亓海刚，米铁柱，
申请(专利权)人：中国海洋大学，上海交通大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]