磷酸二酯酶8A制造技术

本发明专利技术提供了人ＰＤＥ８多肽，编码该多肽的多核苷酸，包括该多核苷酸的表达构建体，用该表达构建体转化的宿主细胞；产生ＰＤＥ８多肽的方法；反义多核苷酸；以及特异性与ＰＤＥ８多肽起免疫反应的抗体。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

总的来说，本专利技术涉及命名为PDE8A的磷酸二酯酶的一个家族以及其应用。
技术介绍
磷酸二酯酶(PDEs)水解3′，5′环核苷酸生成它们各自的5′单磷酸核苷酸。环核苷酸cAMP和cGMP分别由腺苷酰和鸟苷酰环化酶合成，并作为许多细胞信号通路中的第二信使。第二信使信号的持续时间和强度是环核苷酸合成速率和分解速率的函数。已鉴定了PDEs的各个家族。命名系统包括表示PDE家族的第一个数。到目前为止，已知7个家族(PDE1-7)，它们通过(i)一级结构；(ii)底物优选性；(iii)对不同调节剂的反应，(iv)对特异抑制剂的敏感性；和(v)调节方式来分类。表示家族的数后面是表示不同基因的大写字母，大写字母后面的第二个数，表示特异剪接变异体或使用独特转录起始位点的特异转录子。到目前已鉴定的所有哺乳PDEs的氨基酸序列。包括位于蛋白羧基端一半的大约270个氨基酸的高度保守区域。保守结构域包括cAMP和/或cGMP水解的催化位点和两个推定的锌结合位点以及家族特异的决定簇。各种PDEs的氨基端区域是高度可变的，包括其它家族特异决定簇例如(i)钙调蛋白结合位点(PDE1)；(ii)非催化环GMP结合位点(PDE2、PDE5、PDE6)；(iii)膜靶向位点(PDE4)；(iv)疏水的膜相关位点(PDE3)；和(v)对钙调蛋白-依赖的激酶II(PDE1)、cAMP-依赖的激酶(PDE1、PDE3、PDE4)或者cGMP依赖的激酶(PDE5)的磷酸化位点。钙-钙调蛋白可以激活PDE1家族的许多成员。已鉴定三个基因PDE1A和PPE1B优选水解cGMP而PDE1C已表明对cAMP和cGMP都有高度亲和力。PDE2家庭特征是可以特异地由cGMP活化。已经鉴定只有一个基因，PDE2A，其酶产物可以由红-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)特异抑制。PDE3家族中的酶类被cGMP特异性抑制。已知两个基因，PDE3A和PDE3B，对cAMP和cGMP都有高度亲和力，尽管对cGMP水解的Vmax足够低，以至cGMP作为cAMP水解的竞争抑制剂。甲氰吡酮和依诺西酮 特异抑制PDE3酶。PDE4家族影响cAMP水解，并包括4个基因，PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D，每一个都有多个剪接变异体。抗-抑郁的药环戊氧基甲氧苯基吡咯烷酮特异抑制这个家族的成员。PDE5家族的成员在非催化位点结合cGMP，并优先水解cGMP。只有一个基因，PDE5A得到鉴定。光感受器PDE6酶特异水解cGMP。除了伴有三个较小蛋白以形成锥部的PDE的PDE6C，基因包括PDE6A和PDE6B(其蛋白产物二聚体化并结合两拷贝的较小γ抑制亚单位以形成杆部的PDE。PDE7家族影响cAMP水解，但与PDE4家族相比较，不受环戊氧基甲氧苯基吡咯烷酮抑制。只有一个基因，PDE7A，已得到鉴定。已知cAMP和cGMP在细胞内第二信使信号中的重要性，因而本领域存在持续的需要以鉴定另外的PDE种类。至今PDEs未知家族以及其基因和剪接变异体的鉴定将提供另外的药理学途径，以治疗环核苷酸途径异常的病态以及在某些细胞类型中想要调节细胞内cAMP和/或cGMP水平的病态。专利技术简述简而言之，本专利技术提供命名为PDE8的新PDE家族的多肽和其多核苷酸。本专利技术包括自然发生的和非自然发生的PDE8多核苷酸和其多肽产物。自然发生的PDE8产物包括PDE8家族内的不同基因和多肽的种类(即PDE8A)；这些种类包括在相同动物细胞内表达的以及在其它动物细胞内表达的对应种的同系物。在每一个PDE8种类中，专利技术进一步提供由相同多核苷酸编码的剪接变异体，但它们产生于不同的mRNA转录子(即PDE8A1和PDE8A2)。非自然发生的PDE8产物包括自然发生产物的变异体如类似物(即其中一个或更多个的氨基酸得到添加、置换或删除)以及包括共价修饰(即融合蛋白、糖基化变异体、Met-1PDE8s、Met-2Lys-1-PDE8s、Gly-1PDE8s等等)的那些PDE8产物。PDE8家族不同于以前已知的PDE家族，对cAMP和cFMP的水解都表现高亲和，但对其它家族特异的酶抑制剂有相对低的敏感性。在优选的实施方案中，本专利技术提供了包含如SEQ ID NO1中所陈述序列的多核苷酸。本专利技术也包括编码如SEQ ID NO2中所陈述氨基酸序列的多核苷酸。本专利技术目前优选的多肽包括如SEQ ID NO2中所陈述的氨基酸序列。本专利技术提供两个剪接变异体cDNA，它产生两个命名为PDE8A1和PDE8A2的多肽。PDE8A1和PDE8A2多肽以及编码多肽的多核苷酸，在此处作为本专利技术所包括的PDE8酶家族的代表讨论。本专利技术提供编码人PDE8s的新纯化和分离的多核苷酸(如DNA序列和包括其剪接变异体的RNA转录子、正义和互补反义链)。本专利技术的DNA序列包括基因组和cDNA序列以及全部或部分化学合成的DNA序列。如此处所用的“合成的”，在本领域理解为是指与酶学方法相反的用于合成多核苷酸的纯化学方法。“全部”合成的DNA序列因而完全由化学方法合成，而“部分”合成的DNAs包括那些其中只有部分DNA由化学方法合成。编码人PDE8多肽的优选DNA序列如SEQ IDNO1中所陈述。也优选的是编码SEQ ID NO2的PDE8多肽的多核苷酸以及SEQ ID NOS6和4中分别陈述的PDE8A1和PDE8A2的剪接变异体多肽。编码PDE8A1和PDE8A2的优选多核苷酸，分另在SEQ ID NOs5和3中陈述。本专利技术进一步包括种，优选人PDE8 DNA的哺乳类同系物。本专利技术也包括在适度严格条件下与SEQ ID NOs1、3和5中多核苷酸的非编码链或互补杂交的编码PDE8种的DNA序列。本专利技术考虑能杂交但遗传密码多余的编码PDE8A多肽的DNA序列。典型的适度杂交条件如下在65℃、3×SSC、0.1％肌氨酰和20mM磷酸钠pH6.8中杂交，并在65℃带有0.1％SDS的2×SSC中洗涤。在本领域中应该理解通过如Ausebel等(主编)，分子生物学方法，John Wiley &Sons(1994)；PP.6.0.3至6.4.1 0所描述的改变温度和缓中液或盐浓度可以取得同严格的条件。根据探针鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)碱基对的长度和百分率可以经验确定或精确计算修约杂交条件中。如Sambrook等(主编)，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社冷泉港，纽约(1989)，pp.9.47至9.51所描述的可以计算杂交条件。也提供自动复制重组表达构建物如带有PDE8序列的质粒和病毒DNA载体。也提供表达构建物，其中PDE8-编码多核苷酸与内源或外源表达控制DNA序列和转录终止子可操作性连接。根据本专利技术的另一方面，也提供宿主细胞，包括用本专利技术的DNA序列以允许本专利技术PDE8多肽，稳定或瞬时转化表达的方式的原核和真核细胞。本专利技术的宿主细胞是免疫原有价值的来源用于发展特异地与PDE8免疫反应的抗体。本专利技术的宿主细胞在大量合成PDE8多肽的方法中也明显是有用的，其中细胞生长在合适的培养基中，所要的多肽产物从细胞或从细胞生长的培养基中通过例如免疫亲和纯化来分离。PDE8 DNA序列的知识允许修饰细胞从允许或增加内源PDE8的表达。本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码ＰＤＥ８多肽片段或类似物的多核苷酸，其中所述多核苷酸在适度严格条件下与ＳＥＱＩＤＮＯ：１中所示的多核苷酸序列的互补序列杂交，所述适度严格条件包括在６５℃下在２×ＳＳＣ和０．１％ＳＤＳ的终洗涤；其中所述ＰＤＥ８多肽片段或类似物保留 ＰＤＥ８生物活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：K诺克内，
申请(专利权)人：艾科斯有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]