组织保护性细胞因子受体复合物,用于鉴别组织保护性化合物的测定和其用途制造技术

本发明专利技术涉及使用能介导组织保护活性的异源多聚体受体复合物鉴别具有组织保护活性的化合物的方法。该复合物由复合物中的至少一个ＥＰＯ－Ｒ和至少一个β↓［ｃ］受体组成。在鉴别组织保护性化合物的测定中使用的这些化合物包括但不限于小分子和生物制品。使用这些测定鉴别出的化合物可以用于治疗或预防中枢和外周神经系统的各种疾病、障碍或状况以及其他促红细胞生成素－反应性的或可兴奋的细胞、组织和器官的那些疾病、障碍或状况。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,用于鉴别组织保护性化合物的测定和其用途的制作方法本申请要求享有2003年9月30日提交的共同未决的美国专利申请号10/676,694的优先权利益，后者根据35U.S.C.§119(e)要求享有2003年4月25日提交的美国临时专利申请号60/465,891的优先权利益，它们各自的完整内容在这里整体引作参考。1.导言本专利技术涉及用于药物筛选/发现的靶向具有至少一个β共有(βc)受体(也称作CD131)和至少一个促红细胞生成素(EPO)受体的的方法，和治疗或预防方法。更具体地，本专利技术涉及用于鉴别和筛选能调节和配体的相互作用的化合物的方法。本专利技术的方法还包括，使用能调节的活性的化合物，例如通过本专利技术的筛选方法鉴别出的那些化合物，来治疗或预防疾病或障碍的方法。本专利技术还包括，使用能调节的活性的化合物，例如通过本专利技术的筛选方法鉴别出的那些化合物，来增强可兴奋组织的功能的方法。2.专利技术背景各方面的证据表明，促红细胞生成素作为细胞因子超家族的一个成员，起着重要的生理作用，这通过与促红细胞生成素受体(EPO-R)的相互作用来介导。这些作用包括，生成红细胞、发生有丝分裂、调节平滑肌和神经细胞中的钙流入量和影响中间代谢。EPO-R是一种68kDa的蛋白，也是1型细胞因子受体家族的一部分。该家族包括白细胞介素(IL)-IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、IL11、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、血小板生成素、生长激素和促乳素的受体。由于它们的胞外域的同源性，这些受体聚集在一起。这些受体的保守的胞外域长约200个氨基酸，其含有4个在氨基末端区域的位置上保守的半胱氨酸残基(Cys294，Cys 283，Cys 248，Cys 238)和1个位于跨膜结构域附近的Trp-Ser-X-Trp-Ser基序。这4个半胱氨酸似乎对于受体的维持和结构完整性是至关重要的(Murray，1996，Harpers Biochemistry第24版，pp.524-526，Appilion & Lange，Ltd.；Caravella等，1996，ProteinStruct.Funct.Gen.24394-401；)。跟1型细胞因子受体家族中的许多受体一样，EPO-R似乎由它的内源配体EPO的相互作用活化。二聚体中的第一个EPO-R以高亲和力结合EPO，而第二个EPO-R再以低亲和力结合到复合物上。EPO-R的二聚体化使与EPO-R结合的Jak2酪氨酸激酶紧密结合，包括它们的转磷酸作用。该活化导致几种蛋白的酪氨酸磷酸化，这随后活化几个不同的途径，例如磷脂酰肌醇(PI)3-激酶途径、Ras/MAP激酶途径和STAT途径。这些途径触发促红细胞生成素介导的生理功能(Kirito等，2002，Blood 99102-110；Livnah等，1999，Science283987-990；Naranda等，2002，Endocrinology 1432293-2302；Remy等，1999，Science 283990-993；和Yoshimura等，1996，TheOncol.1337-339)。除了形成多聚体外，1型家族的许多成员能将3种不同的信号转导受体组分(gp130、β共有(βc受体)或IL2受体的γ亚基(γc受体))中的一个整合进它们的受体复合物中。例如，GM-CSF的受体复合物由GM-CSF受体、2个βc受体和GM-CSF配体组成。已知EPO-R会与βc受体形成复合物(见Yutaka等，1995，Bioch.Biophys.Res.Com.2081060-1066；Jubinsky等，1997，Blood 901867-1873；D’Andrea等，1998，J.Clin，Invest.1021951-1960)。但是，已经报道，这些复合物不能产生任何生理上相关的作用(Scott等，2000，Blood，961588-1590)。3.概述本专利技术涉及用于药物筛选/发现的靶向“”(下面定义的)，和实现体内组织保护或修复的方法，例如预防或治疗各种疾病、障碍和状况的方法，或提高人受试者或其他哺乳动物的可兴奋组织的功能的方法。本专利技术部分地基于申请人的发现，即EPO受体/βc受体复合物在可兴奋组织的保护中起作用。本文所述的实验证实了，EPO在能表达EPO受体和βc受体两者的野生型细胞中具有保护作用，即减少的细胞凋亡；但是，EPO对缺乏βc受体的细胞没有保护作用。在动物研究中，在野生型小鼠(其能表达2种受体)和βc受体敲除的小鼠(其不表达βc受体)中造成了缺血性脊髓损伤。施用氨甲酰基化的EPO(它是非促红细胞生成的，且不能结合EPO受体二聚体)，会在野生型小鼠中产生提高的恢复。但是，EPO和氨甲酰基化的EPO对βc受体敲除的小鼠的恢复都没有作用。这些结果证明，βc受体的表达对于实现组织保护性作用是必需的。一方面，本专利技术涉及包含EPO受体和βc的在无细胞的筛选测定中鉴别能结合的化合物中的用途。在其他方面，本专利技术涉及包含EPO受体和βc的在基于细胞的筛选测定中鉴别能调节(即增强或抑制)的活性或表现出组织保护活性的化合物中的用途。在其他方面，本专利技术涉及包含EPO受体和βc的在基于动物的筛选测定中鉴别能表现出依赖于的组织保护活性的化合物中的用途。在另一个具体的方面，通过本专利技术的筛选方法鉴别出的化合物能调节和其配体的相互作用，并表现出组织保护活性。在其他的实施方案中，本专利技术提供了治疗或预防疾病、障碍或状况的方法，其包括施用能调节的活性的化合物。另一方面，本专利技术提供了通过施用能调节的活性的化合物，来提高可兴奋细胞、组织或器官的功能的方法。在本专利技术的筛选方法的某些实施方案中，在有和/或没有(例如但不限于EPO)的配体存在的情况下，使实验化合物接触。这样的测定可以用于鉴别能调节配体和的相互作用的化合物。无细胞测定可以用于鉴别能结合的化合物。在这样的实施方案中，使或这样的复合物的膜制剂接触实验化合物，并测量结合的指示。该测定可以是直接的结合测定，其中使化合物接触。在竞争性结合测定中，使2种化合物(例如实验化合物和配体，或2种实验化合物)接触，以确定2种化合物中的哪一种具有更大的结合亲和力。该测定可以是替换结合测定，其中使结合到复合物上的第一种化合物接触，并向测定中加入第二种化合物，以确定第二种化合物是否具有替换第一种结合的化合物的能力。在结合测定中，通过标记加入到测定中的化合物和/或标记，可以测量结合。基于细胞的测定可以用于在有和/或没有的配体存在的情况下，鉴别靶向的化合物。在这样的实施方案中，使能表达的细胞接触实验化合物。为了确定实验化合物是否能调节细胞中的的活性，观察或测量了读数。读数可以是对实验化合物与的结合的简单测量。在某些实施方案中，标记了实验化合物，并通过检测附着到实验化合物上的标记，测量了标记的实验化合物与的结合。在其他的实施方案中，读数是表型变化，例如细胞大小、形状或细胞凋亡的变化。在其他的实施方案中，读数是报告基因的表达或装载到细胞中的或包含在培养基中的指示染料的变化。在这样的实施方案中，在测定中采用的细胞是基本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，其包括：（ａ）使实验化合物接触组织保护性细胞因子受体复合物；（ｂ）测量组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平；（ｃ）鉴别与在没有实验化合物存在的情况下测得的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平相比，能提高或降低组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平的实验化合物；和（ｄ）测定鉴别出的实验化合物的组织保护活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M布赖恩斯，A切拉米，P赫兹，F费奥尔达利索，M弗拉特利，M莱斯特，M尼尔森，T萨格尔，LO彼得森，J格尔韦恩，T科尔曼，
申请(专利权)人：肯尼思S沃伦协会有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]