本发明专利技术公开了一种净化沙丁胺醇和／或克伦特罗的方法及其专免疫亲和色谱柱。该净化沙丁胺醇和／或克伦特罗的免疫亲和色谱柱装载有免疫亲和吸附剂，该吸附剂是由固相载体和与其偶联的沙丁胺醇多克隆抗体或单克隆抗体组成；所述沙丁胺醇多克隆抗体或沙丁胺醇单克隆抗体是以沙丁胺醇半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的。本发明专利技术的提纯方法结合色谱法高效检测沙丁胺醇和克伦特罗的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种净化沙丁胺醇和/或克伦特罗的方法及其专用免疫亲和色谱柱。
技术介绍
随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。免疫亲和色谱(IAC，immunoaffinity chromatography)是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。其高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。在兽药残留分析中，IAC最简单而且最有效的应用方式是作为理化测定技术(如HPLC，GC/MS)的样品净化手段，这种联用方法可使免疫学技术和理化技术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，并避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。沙丁胺醇(SAL)与克伦特罗(CL)都属于苯乙醇胺类β-兴奋剂，用于医学临床，主要用于扩张支气管和增加肺通气量，可治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痉挛和休克等症，在兽医临床用作牛、马的产道松弛剂，如SAL用于平喘，CL作为子宫松驰剂等，近年来作为饲料添加剂，在畜牧业非法使用的情况越来越严重。许多国家建立了沙丁胺醇与克伦特罗的残留检测方法并且多数国家都禁止其在动物生产过程中使用。有些国家执行最高残留量(MRLs)限制，如英国规定的MRLs为0.5ng/g，荷兰规定的MRLs为1ng/g。我国明确规定禁止CL、SAL及其制剂在食品动物的饲养过程中使用。目前检测沙丁胺醇与克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC-UV)、气-质联机法(GC-UV)、液-质联机(LC-MS-MS)和酶联免疫法(ELISA)等。这些方法的前处理利用液-液分配，常规的SPE柱净化和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种净化沙丁胺醇和/或克伦特罗的方法及其专用免疫亲和色谱柱。本专利技术所提供的净化沙丁胺醇和/或克伦特罗的免疫亲和吸附剂是由固相载体和与其偶联的沙丁胺醇多克隆抗体或沙丁胺醇单克隆抗体组成；所述沙丁胺醇多克隆抗体或沙丁胺醇单克隆抗体是以沙丁胺醇半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述沙丁胺醇半抗原是将沙丁胺醇完全溶于甲醇，然后将甲醇蒸干，得到油状物，溶解于无水乙醇中，在振荡的同时加入琥珀酸酐，室温振荡反应3小时，便有白色混悬物出现，该白色混悬物即为半抗原。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用载体蛋白。沙丁胺醇是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本专利技术将沙丁胺醇(SAL)用琥珀酸酐酰化，接出了一个含4个碳的间隔臂形成半抗原，这样突出了沙丁胺醇半抗原决定簇的特征结构，有助于制出针对沙丁胺醇抗原特异性较强的抗体。再将沙丁胺醇半抗原采用混合酸酐法与载体蛋白偶联得到免疫原。半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为12∶1和15∶1。所述沙丁胺醇鼠单克隆抗体优选为对沙丁胺醇和克伦特罗都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的单克隆抗体。所述对沙丁胺醇和克伦特罗都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-2-1CGMCC No.1607已于2006年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。所述固相载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶等，优选为Sepharose 4B。所述免疫亲和吸附剂可装载入柱中制成免疫亲和色谱柱，该免疫亲和色谱柱也属于本专利技术的保护范围。含有上述免疫亲和吸附剂或免疫亲和色谱柱的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。所述试剂盒中还包括洗脱液I和洗脱液II；所述洗脱液I为甲醇；所述洗脱液II为乙醇∶去离子水∶pH4.0的乙酸缓冲液的体积比为80∶15∶5的混合液。所述试剂盒中还包括洗涤液、保存液；所述洗涤液为pH7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述pH7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为1L水中含磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g；所述保存液为1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，NaN30.2g，pH7.4。该免疫亲和吸附剂基于免疫反应和色谱反应，适合从生物样品(如动物尿液)中提纯沙丁胺醇和克伦特罗，便于残留分析。在该免疫亲和吸附剂中，沙丁胺醇鼠单克隆抗体和沙丁胺醇兔多克隆抗体与溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率分别是97.2±1.5％，96.7±1.5％，该沙丁胺醇多克隆抗体或对沙丁胺醇和克伦特罗都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的单克隆抗体对克伦特罗有很高的交叉反应性，偶联有对沙丁胺醇和克伦特罗都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-2-1 CGMCC No.1607分泌的单克隆抗体的免疫亲和色谱柱对沙丁胺醇和克伦特罗动态柱容量分别为400ng/mL和419ng/mL，绝对柱容量分别为40ng/mgIgG和42ng/mg IgG，连续使用10次后柱容量降为总柱容量的55％左右，保存期为1年。本专利技术所提供的净化沙丁胺醇和/或克伦特罗的方法，包括以下步骤1)样品的前处理动物尿样将样品用洗涤液稀释10倍；动物组织在匀浆样品中，加入0.01M盐酸溶液，涡动3分钟，3000g离心10分钟，将得到上清液经0.2um的滤膜过滤后，用洗涤液稀释10倍，得到样品溶液；2)将步骤.1)得到的样品溶液过免疫亲和色谱柱，然后用去离子水洗涤，再用上述3ml洗脱液I和1ml洗脱液II同时洗脱，得到纯化的沙丁胺醇和/或克伦特罗溶液。本专利技术的免疫亲和吸附剂具有高选择性，使样品前处理过程大大简化，尤其适用于动物尿样、肝脏、肌肉样品中沙丁胺醇和/或克伦特罗的前处理，分析质量得到改善。免疫亲和吸附剂的高选择性使得沙丁胺醇和/或克伦特罗分析方法的检测限将主要取决于取样量，这是单纯理化手段难以达到的；本专利技术的免疫亲和吸附剂对待测组分有很强的保留和浓缩能力，只要加样量不超过柱容量，在实测样品条件下免疫亲和吸附剂对组分的保留能力几乎不受样品体积或组分浓度的影响。本专利技术的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本专利技术的方法水相操作，操作简单，净化效果好，免疫亲和色谱柱能重复使用，能节省大量的有机溶剂，降低分析成本和环境污染。本专利技术的提纯方法结合色谱法高效检测沙丁胺醇和克伦特罗的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。附图说明图1为沙丁胺醇和克伦特罗标准品的色谱2为在猪尿中沙丁胺醇和克伦特罗净化样品效果色谱图 具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、净化沙丁胺醇和/或克伦特罗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种净化沙丁胺醇和／或克伦特罗的免疫亲和吸附剂，是由固相载体和与其偶联的沙丁胺醇多克隆抗体或沙丁胺醇单克隆抗体组成；所述沙丁胺醇多克隆抗体或沙丁胺醇单克隆抗体是以沙丁胺醇半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述沙丁胺醇半抗原是将沙丁胺醇完全溶于甲醇，然后将甲醇蒸干，得到油状物，溶解于无水乙醇中，在振荡的同时加入琥珀酸酐，室温振荡反应３小时，便有白色混悬物出现，该白色混悬物即为半抗原。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，何方洋，王建平，史为民，吴聪明，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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