控制志贺菌分子传播流行的方法技术

本发明专利技术公开了一种控制方法，特别公开了一种控制志贺菌分子传播流行的方法。该方法包括如下步骤：（１）确定一地区菌痢流行的主要血清型及不同地区是否存在差异；（２）初步建立该地区志贺菌ＤＮＡ指纹图谱分型数据库；（３）按照ＣＬＳＩ要求对所收集的志贺菌进行纸片扩散法药敏试验；（４）分析明确其基因型；（５）了解志贺菌中是否存在质粒介导的喹诺酮耐药；（６）对整合子的全可变区测序分析来了解耐药性传播的分子机制；（７）进一步阐述或发现新的耐药机制。本发明专利技术将把多重耐药志贺菌中的质粒、整合子及耐药基因有机联系起来，系统研究其耐药性转移的机制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种控制方法，特别涉及一种。
技术介绍
控制志贺菌爆发流行的一项重要措施是快速溯源，切断传播途径，脉冲场凝胶电泳(PFGE)指纹图谱分析分辨力高，重复性好被认为是对致病菌分型的″金标准″。美国由HHS/CDC、若干卫生部门及实验室于1996基于PFGE技术，建立了PulseNet，在2001年达到全国共享。在标准的检测技术和分析程序下对病原细菌进行分子分型监测、并交流信息的数据库工作网络，用于食源性病原体暴发流行的分型、追踪、溯源和应对。显著地提高了发现疾病大规模爆发的监控能力。我国对志贺菌的分型主要是血清学方法PFGE未见报道，无法有效预防和监测菌痢的爆发流行。本专利技术所在实验室具有PFGE相关设备，积累了一定的经验，将对本省分离的志贺菌进行PFGE指纹图谱分析阐明本省菌痢流行的分子特征，建成我省志贺菌指纹图谱数据库，并争取使本试验室能成为PulseNet China的一个分支。肠杆菌科细菌对三代头孢菌素的耐药机制主要是产生质粒介导的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶，我国志贺菌对三代头孢菌素耐药机制的研究未见报道，本专利技术实验室已建立了检测临床致病菌ESBLs、AmpC酶的表型和基因型的成熟技术，在国内率先报道了DHA-1质粒AmpC酶，通过这些技术我们将阐明我省志贺菌对三代头孢菌素的耐药机制。我国是目前世界上细菌对喹诺酮耐药性最高的国家，通过对质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnr耐药机制的深入研究，将使我们更加深入和全面的阐述细菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药机制。在志贺菌中，国外对氟喹诺酮耐药机制的研究很少，尤其是质粒介导的耐药。我国质粒介导的耐药也未见报道，本专利技术将充分利用我国丰富的耐药菌基因资源对质粒介导的喹诺酮耐药机制进行深入研究。耐药质粒的水平转移是志贺菌耐药性日益严重的主要原因。最近的研究显示整合子在志贺菌的多重耐药性方面起着重要作用。国外已发现了两类整合子的存在，其可变区往往同时携带多个耐药基因盒，但有关整合子与三代头孢菌素和氟喹诺酮耐药基因关系的研究则很少，国内也未见报道。如何及时准确的识别菌痢爆发的流行株？某地区志贺菌的分子流行特征及耐药特点如何？他们对三代头孢菌素及喹诺酮耐药机制是什么？上述耐药性的播散由何种机制介导？通过本方法我们将全面系统的回答上述问题。
技术实现思路
本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种将把多重耐药志贺菌中的质粒、整合子及耐药基因有机联系起来，系统研究其耐药性转移机制的。本专利技术是通过如下技术方案实现的一种，其特殊之处在于包括如下步骤(1)对收集自某地区的志贺菌进行血清学分型，确定这一地区菌痢流行的主要血清型及不同地区是否存在差异；(2)严格按照美国疾病预防和控制中心分子分型网站PulseNetUSA提供的针对志贺菌的标准试验方案对收集的志贺菌进行脉冲场凝胶电泳，通过BioNumerics软件分析确定各地区菌痢流行的分子亚型及地区间的相关性，初步建立该地区志贺菌DNA指纹图谱分型数据库；(3)按照CLSI要求对所收集的志贺菌进行纸片扩散法药敏试验，了解这一地区志贺菌对不同抗菌药物的表型耐药特征并筛选出对三代头孢菌素和氟喹诺酮类抗菌药物耐药的菌株；(4)用双纸片平行抑制试验及三相水解试验检测耐三代头孢菌素的志贺菌中的超广谱β内酰胺酶和AmpC酶，通过等电聚焦电泳、特异PCR引物扩增及其产物的序列分析明确其基因型；(5)对氟喹诺酮类抗菌药物耐药的菌株通过PCR扩增DNA促旋酶gyrA、拓扑异构酶IVparC喹诺酮耐药决定区QRDRs并对产物测序分析，明确志贺菌染色体介导的喹诺酮耐药的机制，设计特异的PCR引物扩增质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB和qnrS，了解志贺菌中是否存在质粒介导的喹诺酮耐药；(6)通过对多重耐药的志贺菌株进行质粒图谱分析、接合试验、转化试验、southern杂交、PCR扩增检测1、2、3类整合子的整合酶基因intI并对整合子的全可变区测序分析来了解耐药性传播的分子机制；(7)对新发现的耐药酶、耐药位点及通过前述方法无法明确的耐药现象进行随机分子克隆进一步阐述或发现新的耐药机制。本专利技术存在以下特点1.本专利技术对某地区分离的志贺菌进行PFGE指纹图谱分析，建立数据库，阐明该地区菌痢流行的分子特征，并争取使本试验室能成为PulseNet China的一个分支。2.本专利技术实验室经多年研究已建立了检测临床致病菌ESBLs、AmpC酶的表型和基因型的成熟技术，在国内率先报道了DHA-1等质粒AmpC酶，通过这些技术我们阐明志贺菌对三代头孢菌素的耐药机制。3.我国是目前世界上细菌对喹诺酮耐药性最高的国家，肠杆菌科细菌对氟喹诺酮的耐药机制主要是编码DNA促旋酶gyrA、拓扑异构酶IVparC的喹诺酮耐药决定(QRDRs)发生基因突变，而最近发现的质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnr则改变了传统的染色体介导的观点，而且当细菌获得qnr基因后其本身QRDR碱基突变的几率明显升高，通过对此机制深入研究将使我们更加深入和全面的阐述细菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药机制。在志贺菌中由于国外的菌株对氟喹诺酮的敏感率高而很少能获得耐药株，所以有关其耐药机制的研究很少，尤其是质粒介导的耐药。我国有少数在福氏志贺菌中检测染色体QRDRs突变的报道，但其研究均局限于单一的血清型或局部地区的菌株，而质粒介导的耐药也未见报道，本专利技术充分利用我国丰富的耐药菌基因资源对上述机制进行了深入研究。4.志贺菌的耐药性日益严重，耐药质粒的水平转移是其主要原因第一个耐药″R″质粒，第一个介导四环素耐药质粒，第一个介导喹诺酮耐药质粒均是首次在志贺菌中发现，而最近的研究显示整合子在志贺菌的多重耐药性方面则起着重要作用。整合子的一个显著特点是具有突出的基因捕获及表达能力。目前在细菌耐药中的作用是国内外的一个研究热点，志贺菌中整合子的研究方面国外已发现了两类整合子的存在，其可变区同时携带多个耐药基因盒，如dfaA、oxa、tet、cat等分别介导对磺胺、氨苄西林、四环素和氯霉素的耐药，但有关整合子与三代头孢菌素和氟喹诺酮耐药基因关系的研究很少，国内也未见报道。本专利技术将把多重耐药志贺菌中的质粒、整合子联系起来，有所突破。本专利技术将把多重耐药志贺菌中的质粒、整合子及耐药基因有机联系起来，系统研究其耐药性转移的机制，并对整合子的全可变区测序分析来了解耐药性传播的分子机制，作到了有所突破。具体实施方式实施例的技术路线包括如下步骤(1)血清学分型对收集的志贺菌通过生化试验进行菌种鉴定，并采用志贺菌属多价诊断血清对志贺菌属的四种血清型及其不同的亚型进行血清学分型。(2)药敏试验按照NCCLS规定，采用纸片扩散法对上述菌株进行药敏试验，质控菌株ATCC25922，所选用的抗菌药物纸片包括氨苄西林、四环素、萘定酸、复方磺胺、环丙沙星、头孢噻肟和头孢他啶。上述试验中对氟喹诺酮和三代头孢菌素耐药的菌株用Etest试条(瑞典AB BIODISK公司)检测其MIC值，用WHONET5.3软件对药敏结果进行分析。(3)脉冲场凝胶电泳(PFGE)严格按照PulseNetUSA提供的针对志贺菌的标准试验方案进行，(http//www.cdc.gov/pulsenet/protocols/ecoli_salmon本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种控制志贺菌分子传播流行的方法，其特征在于：包括如下步骤：（１）对收集自某地区的志贺菌进行血清学分型，确定这一地区菌痢流行的主要血清型及不同地区是否存在差异；（２）严格按照美国疾病预防和控制中心分子分型网站ＰｕｌｓｅＮｅｔ ＵＳＡ提供的针对志贺菌的标准试验方案对收集的志贺菌进行脉冲场凝胶电泳，通过ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ软件分析确定各地区菌痢流行的分子亚型及地区间的相关性，初步建立该地区志贺菌ＤＮＡ指纹图谱分型数据库；（３）按照ＣＬＳＩ要求对所收集的志贺 菌进行纸片扩散法药敏试验，了解这一地区志贺菌对不同抗菌药物的表型耐药特征并筛选出对三代头孢菌素和氟喹诺酮类抗菌药物耐药的菌株；（４）用双纸片平行抑制试验及三相水解试验检测耐三代头孢菌素的志贺菌中的超广谱β内酰胺酶和ＡｍｐＣ酶，通过等 电聚焦电泳、特异ＰＣＲ引物扩增及其产物的序列分析明确其基因型；（５）对氟喹诺酮类抗菌药物耐药的菌株通过ＰＣＲ扩增ＤＮＡ促旋酶ｇｙｒＡ、拓扑异构酶ⅣｐａｒＣ喹诺酮耐药决定区ＱＲＤＲｓ并对产物测序分析，明确志贺菌染色体介导的喹诺酮耐药的 机制，设计特异的ＰＣＲ引物扩增质粒介导的喹诺酮类耐药基因ｑｎｒＡ、ｑｎｒＢ和ｑｎｒＳ，了解志贺菌中是否存在质粒介导的喹诺酮耐药；（６）通过对多重耐药的志贺菌株进行质粒图谱分析、接合试验、转化试验、ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、ＰＣＲ扩增检测 １、２、３类整合子的整合酶基因ｉｎｔⅠ并对整合子的全可变区测序分析来了解耐药性传播的分子机制；（７）对新发现的耐药酶、耐药位点及通过前述方法无法明确的耐药现象进行随机分子克隆进一步阐述或发现新的耐药机制。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，
申请(专利权)人：王勇，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]