本发明专利技术提供一种中药水蛭ＨＰＬＣ指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱。首先制备水蛭药材溶液，取水蛭最粗粉适量，精密称重，以生理盐水作为溶剂室温浸泡１６小时，离心，取上清液用微孔滤膜（０．４５ｕｍ）过滤，作为水蛭对照药材溶液；其次制备参照物溶液，取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；最后，进行测定，分别精密吸取水蛭对照药材溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录５０分钟色谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾溶液和５０％甲醇的梯度洗脱液，检测波长为２５４ｎｍ。将待测水蛭样品指纹图谱与标准指纹图谱对比，比较其异同。本发明专利技术的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体来说，是采用高效液相色谱法(HPLC)来建立水蛭药材指纹图谱以及用指纹图谱来鉴别水蛭药材。
技术介绍
水蛭作为经典的破血逐淤药物，为中国药典所收载。中国药典收载的水蛭药材品种有三种，其中作为药用主要品种为水蛭科动物蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)。水蛭的主药成分为蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、酶、糖类以及微量元素等。对水蛭中蛋白质、氨基酸、糖类及微量元素等成分的定性、定量研究已多有报道，主药方法为薄层色谱法、高效液相色谱法、电泳法等。其中小分子成分主要为次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷等，嘧啶和嘌呤均为含有N原子的不饱和的杂环化合物。水蛭药材成分复杂，如果单用其中个别活性成分来说明水蛭药材内在质量，具有一定的片面性。要控制水蛭药材质量，最好采用它的物质群整体予以控制。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of IndustryBotanical Drug(Draft).2000 August)。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。
技术实现思路
关于水蛭成分测定和药材鉴别的方法有许多报道，但对水蛭指纹图谱的建立方法却未见报道。为此，专利技术人对水蛭指纹图谱的建立方法进行了研究，对水蛭10批药材进行了测定，建立起水蛭指纹图谱测定方法。本专利技术的目的是通过对水蛭水溶性提取物HPLC指纹图谱的研究，摸索出一种水蛭药材质量控制的方法，确立建立水蛭的标准指纹图谱的方法，借此可将水蛭指纹谱作为质量控制及真伪鉴别的指标之一。本专利技术还同时提供了水蛭的标准指纹图谱。本专利技术通过下列步骤实施 一种水蛭指纹图谱的建立方法，包括如下步骤(1)水蛭药材溶液的制备取水蛭药材适量，精密称重，以氯化钠溶液作为溶剂进行提取，提取液经微孔滤膜过滤，作为水蛭药材溶液；其中，所述的氯化钠溶液优选用生理盐水。(2)参照物溶液的制备取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；(3)测定分别精密吸取水蛭药材溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定水蛭指纹图谱，其中高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐-水-甲醇梯度洗脱液，检测波长为220nm～300nm；其中，所述的磷酸盐优选为磷酸二氢钾。其中，所述的水蛭药材，可以为粗粉或1cm水蛭段，优选使用水蛭最粗粉，即能全部通过筛孔内径为2000±70um或10目筛，但混有能通过筛孔内径为355±13um或50目筛不超过20％的粉末。其中，所述的提取可以为冷浸提取或常温(室温)浸泡提取，其中优选使用常温(室温)浸泡提取。提取时间可以为12～36小时，优选为室温浸泡提取16小时。其中，流动相为磷酸盐-水-甲醇不同比例溶液，优选用磷酸二氢钾水溶液和甲醇水、更优选为0.01mol/L磷酸二氢钾和50％甲醇溶液，按梯度配比作为流动相。其中，检测波长可以选用230nm、254nm、294nm三中波长，其中优选使用254nm。其中，建立水蛭标准(或对照)指纹图谱的方法，包括如下步骤(1)水蛭对照药材溶液的制备取水蛭最粗粉适量，精密称重，以0.9％生理盐水作为溶剂室温浸泡16小时，离心，取上清液用微孔滤膜(0.45um)过滤，作为水蛭对照药材溶液；(2)参照物溶液的制备取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液；(3)测定分别精密吸取水蛭标准品溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录50分钟色谱，其中高效液相色谱条件为色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和50％甲醇的梯度洗脱液，检测波长为254±1nm。其中，所述的流动相梯度为按体积比计算，A0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，B50％甲醇 其中，柱温为室温；流速为0.8～1ml/min，理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于7000。其中，上述所述的水蛭标准指纹图谱建立方法，得到的水蛭标准指纹图谱中，共有特征指纹峰有15个，其峰面积总和占总峰面积的90％以上。非共有峰的峰面积占总峰面积小于10％。以次黄嘌呤的色谱峰(标号为S)的相对保留时间和相对峰面积为1，所得到的水蛭标准指纹图谱中共有特征指纹峰选自1号峰相对保留时间0.317～0.354，相对峰面积0.055～0.113；2号峰相对保留时间0.462～0.521，相对峰面积0.017～0.093；3号峰相对保留时间0.528～0.561，相对峰面积0.111～0.333；4号峰相对保留时间0.590～0.642，相对峰面积0.009～0.028；5号峰相对保留时间0.718～0.773，相对峰面积0.004～0.102；S号峰(参照峰)相对保留时间1，相对峰面积1；6号峰相对保留时间1.196～1.206，相对峰面积0.050～0.180；7号峰相对保留时间1.314～1.451，相对峰面积0.026～0.116；8号峰相对保留时间1.431～1.607，相对峰面积0.005～0.098；11号峰相对保留时间1.986～2.223，相对峰面积0.064～0.139；12号峰相对保留时间2.045～2.300，相对峰面积0.012～0.021；13峰相对保留时间2.240～2.510，相对峰面积0.036～0.107；14号峰相对保留时间2.408～2.720，相对峰面积0.015～0.030；15号峰相对保留时间2.580～2.903，相对峰面积0.022～0.039；16号峰相对保留时间2.869～3.173，相对峰面积0.011～0.037。优选，以次黄嘌呤的色谱峰(标号为S)的相对保留时间和相对峰面积为1，所得到的水蛭标准指纹图谱中共有特征指纹峰选自1号峰相对保留时间0.333，相对峰面积0.078；2号峰相对保留时间0.487，相对峰面积0.053；3号峰相对保留时间0.545，相对峰面积0.195；4号峰相对保留时间0.615，相对峰面积0.015；5号峰相对保留时间0.738，相对峰面积0.047；S号峰(参照峰)相对保留时间1，相对峰面积1；6号峰相对保留时间1.202，相对峰面积0.105；7号峰相对保留时间1.385，相对峰面积0.090；8号峰相对保留时间1.517，相对峰面积0.041；11号峰相对保留时间2.101，相对峰面积0.093；12号峰相对保留时间2.171，相对峰面积0.016；13峰相对保留时间2.373，相对峰面积0.063；14号峰相对保留时间2.564，相对峰面积0.024； 15号峰相对保留时间2.743，相对峰面积0.029；16号本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水蛭指纹图谱的建立方法，包括如下步骤： （１）水蛭药材溶液的制备：取水蛭药材适量，精密称重，以氯化钠溶液（优选生理盐水）作为溶剂进行提取，提取液经微孔滤膜过滤，作为水蛭药材溶液； （２）参照物溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称重，用流动相溶解、稀释，制成参照物溶液； （３）测定：分别精密吸取水蛭药材溶液与参照物溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定水蛭指纹图谱，其中高效液相色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐（优选磷酸二氢钾）－水－甲醇梯度洗脱液，检测波长为２２０ｎｍ～３００ｎｍ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李振国，
申请(专利权)人：李振国，
类型：发明
国别省市：23[中国|黑龙江]
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