本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列。其特征是：它通过噬菌体随机肽库联合ＭＴＴ体外药敏试验筛选，得到能够逆转胃癌耐药细胞耐药特性的噬菌体克隆多肽，其能够降低胃癌耐药细胞在化疗药物作用下的生存率和ＩＣ５０值，并有统计学差异的克隆（ｐ＜０．０５）。它利用噬菌体多肽筛选全细胞能够同时筛选肿瘤耐药细胞膜上所有特异性表达分子的配体，并通过功能筛选直接得到有生物活性的能够逆转肿瘤耐药细胞耐药特性的多肽，同时提供一种人胃癌多药耐药细胞特异性结合及具有逆转耐药特性，生物活性短肽及其序列（ＧＭＢＰｓ）。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学
，具体涉及人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列。
技术介绍
胃癌是我国引起死亡人数最多的恶性肿瘤，化疗是当前治疗胃癌的主要手段之一，但其治疗效果仍无重大进展，其主要原因就是胃癌细胞对化疗药物产生多药耐药。肿瘤细胞的多药耐药性(multi-drug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药后，对其它化学结构及机理不同的化疗药物也产生交叉耐药性。目前的研究表明，肿瘤细胞多药耐药性的产生主要与以下机制有关1.发生在细胞膜水平的药物摄取减少和外排增多，引起细胞内药物的绝对浓度降低，如由P-糖蛋白引起的耐药；2.发生在细胞质和细胞器水平的药物亚细胞分布的改变，使药物无法接近其作用靶点，引起药物有效浓度降低；3.药物靶点在质和量的改变，如拓扑异构酶II表达降低，减弱了以此酶为靶点的药物的细胞毒性；4.细胞解毒系统功能加强，使药物迅速灭活，如与谷胱甘肽转移酶(GST)有关的耐药等。这些机制多是共同起作用，其中肿瘤细胞上某些膜蛋白的过多表达是产生多药耐药的主要原因。目前发现的与多药耐药有关的膜蛋白有三种P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药蛋白(multidrug resistance protein，MRP)、乳腺癌耐药相关蛋白(Breastcancer resistance protein，BCRP)，这三种膜蛋白在肿瘤细胞膜上行使着“分子泵”的功能，即将化疗药物从细胞内“泵”出，使肿瘤细胞免受化疗药物的杀伤(NatureBiotechnology.2000；18SupplIT18-20)。目前人们针对肿瘤细胞膜上已知的耐药相关分子采用单克隆抗体及单链抗体(scFv)进行肿瘤耐药程度及预后的判断，以及肿瘤耐药细胞的靶向及逆转耐药治疗，如抗P-gp单克隆抗体MRK-16(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992；895824-5829；JControl Release 2001；77(1-2)77-86)能逆转肿瘤耐药，而抗FAS(Urology 2001；57(5)993-998)单克隆抗体则能明显提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度。但单克隆抗体、单链抗体(scFv)以及生物工程抗体等。但单抗有难以克服的缺陷，如免疫原性较强、相对缺乏C区依赖的功能效应及穿透能力较弱等。虽然ScFv具有分子量较小，免疫原性弱，渗透力强，并可用于药物导向，中和毒素等优点，但其无抗体C区，不能介导抗体的其它生物学效应。目前筛选到的单克隆抗体及单链抗体(scFv)治疗只是针对已知的膜表面耐药分子，如P-gp、MRP、BCRP等，而且用来筛选相应抗体及单抗的分子是人工表达或合成纯化的分子，其构象及功能表位特征与细胞表面生理状态下的分子还有一定的差异。而且对于表达和纯化困难的细胞膜表面抗原难以进行相关配体的筛选。目前耐药逆转治疗的效果还不理想，其主要原因之一还在于有很多与耐药相关的分子尚未被发现，其中包括很多膜表面耐药分子。我们知道在耐药肿瘤细胞膜表面存在着与药敏肿瘤细胞不同的膜分子表达谱，或者一些膜分子在耐药细胞的构象发生改变，这些膜分子的改变都是肿瘤细胞在化疗药物持续存在的压力下，为对抗化疗药物对细胞的作用而被诱导表达的，发生这些改变的膜分子与肿瘤细胞的耐药存在着必然的联系。因此寻找能够特异性结合及改变这些耐药相关膜分子生物学功能的配体，对于逆转耐药的治疗以及胃癌耐药相关分子的研究都有重要的现实及理论意义。而目前筛选逆转耐药配体的策略只能是针对已知膜表面的耐药分子，无法直接找到未知的膜表面耐药分子的配体。鉴于目前寻找耐药肿瘤细胞靶向及逆转治疗分子中存在的不足，我们采用噬菌体随机肽库筛选完整的活的肿瘤耐药细胞，可以筛选到与生理状态下细胞膜表面分子结合的多肽，可以找到未知耐药相关分子的配体。多肽分子分子量更小，穿透能力强，没有抗原性，可具有生物活性的特点，更适合在体内应用。用噬菌体随机呈现肽库筛选完整的细胞，对于细胞表面分子复杂多变的肿瘤细胞尤其适合(Curr Opin Chem Biol.2000 Feb；4(1)16-21)。噬菌体随机肽库活细胞筛选有很多优势，首先不要求预先确定目的的受体；除了筛选结合的受体外，还可以筛选内化的受体。Johnston和其同事用这种方法获得了表达20肽的噬菌体不但能够和纤维母细胞结合，并且能够内化进入细胞(Nat Genet 2001 Jan；27(1)6-8)。Hartley O等应用噬菌体肽库成功地筛得与表达在CHO-CCR5细胞及HEK-CCR5细胞表面的CCR5特异性结合的多肽(J Virol.2003 Jun；77(12)6637-44)。已知技术利用噬菌体随机肽库体内筛选到了与肿瘤血管内皮细胞特异性结合的短肽，申请号200510042810.4的专利申请，利用噬菌体随机肽库体外消减筛选胃癌血管内皮细胞体外培养模型，得到了与胃癌血管内皮细胞特异性结合的短肽。这表明以活细胞作为筛选靶标可以筛得能与细胞膜表面分子特异结合的多肽配基。但是200510042810.4的专利只是简单的筛选与细胞特异性结合的多肽，并没有针对性的筛选对细胞功能有影响的多肽。而本研究筛选的方法中加入了针对细胞功能的筛选，比其的优势在于能够直接筛选到对肿瘤细胞耐药功能有影响的多肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列，它利用噬菌体多肽筛选全细胞能够同时筛选肿瘤耐药细胞膜上所有特异性表达分子的配体，并通过功能筛选直接得到有生物活性的能够逆转肿瘤耐药细胞耐药特性的多肽，同时提供一种人胃癌多药耐药细胞特异性结合及具有逆转耐药特性，生物活性短肽及其序列(GMBPs)。本专利技术的技术方案是提供人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列，其特征是它通过噬菌体随机肽库联合MTT体外药敏试验筛选，得到能够逆转胃癌耐药细胞耐药特性的噬菌体克隆多肽，其能够降低胃癌耐药细胞在化疗药物作用下的生存率和IC50值，并有统计学差异的克隆(p＜0.05)。所述的人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽序列选择下列序列之一GMBP1 E T A P L S T M L S P YGMBP2 T T F S P P S P L S S I；GMBP3 F N N H Y P A A A T Y P；GMBP4 E V F W P L N A P R L L；GMBP5 S WQ I P Y P I S P R S；GMBP6 K T A P T P Y A L V H D；GMBP7 S N F M H N T R I W S H；GMBP8 S W Q I T Y P I S P R S；GMBP9 A W T W V L P S S I R A；GMBP10T D S Y H V A S A R Q P；GMBP11S T Y S H P L S L R P 本文档来自技高网...
【技术保护点】
人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列，其特征是：它通过噬菌体随机肽库联合ＭＴＴ体外药敏试验筛选，得到能够逆转胃癌耐药细胞耐药特性的噬菌体克隆多肽，其能够降低胃癌耐药细胞在化疗药物作用下的生存率和ＩＣ５０值，并有统计学差异的克隆（ｐ＜０．０５）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林涛，丁杰，梁树辉，韩全利，吴开春，樊代明，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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