抑制胞吞作用的单链寡核苷酸制造技术

本发明专利技术提供了用于预防或治疗受试者的流感病毒感染的单链寡核苷酸(ssON)，其中单链寡核苷酸是抑制胞吞作用的单链寡核苷酸。本发明专利技术还提供了一种单链寡核苷酸(ssON)，所述单链寡核苷酸(ssON)包含具有与表1中列出的SEQ ID NO:13‑21中的任一序列或其互补序列共有至少60％序列同一性的序列的多核苷酸或由该多核苷酸组成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抑制胞吞作用的单链寡核苷酸本专利技术涉及寡核苷酸，并且特别是在预防或治疗流感病毒感染和皮肤和/或皮下组织的紊乱中有用的寡核苷酸。流感病毒(IV)是一种具有单链负义RNA基因组的包膜病毒。它是高度传染性的(contagious)，频繁全球爆发。该病毒属于正粘病毒(Orthomyxovirus)科，并且被分类为三种抗原类型：A、B和C(vandeWakker等人，EurJPharmacol,809:178-190)。仅IVA和B亚型引起大规模爆发和严重疾病。季节性IV流感影响多达～20％的世界人口，并且每年导致超过250,000-500,000人死亡(vandeWakker等人，EurJPharmacol，809:178-190)。由于RNA聚合酶的不可靠性，病毒蛋白不断突变。因为遗传漂变和遗传漂移，新的IV病毒不断出现，使得先前获得的免疫力不再适宜且抗病毒药物可能不太有效。由于IV的高突变率，现有疫苗的效力是可变的，并且需要每年开发新的疫苗。目前，有两类抗IV药物被FDA批准用于临床使用：M2蛋白抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺，以及神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和扎那米韦。针对这些药物产生了越来越多的耐药毒株，并且这些药物的使用往往伴随着不利的副作用。因此，对于开发具有新的抗IV作用机制的替代抗IV剂存在迫切需求。寡核苷酸是短的DNA或RNA分子或寡聚物，其具有广泛的应用。“CpG寡核苷酸”(或CpG-ssON)是短的单链的合成DNA或RNA分子，其包含胞嘧啶三磷酸酯核苷酸(“C”)、胞嘧啶三磷酸酯核苷酸(“C”)之后为鸟嘌呤三磷酸酯核苷酸(“G”)。含非甲基化CpG的核酸刺激免疫系统，并且可以用于治疗感染性疾病、过敏、哮喘和其他紊乱(Scheiermann,J.和Klinman,D.M.2014.Vaccine32:6377-6389；Aryan,Z.和Rezaei,N.2015.CurrOpinAllergyClinImmunol.15:568-74)。已经显示ssDNA-ODN配体中的CpG序列是Toll样受体9(TLR9)活化不可或缺的，TLR9在病原体识别和固有免疫活化中发挥重要作用。当CpG重复序列被去除时，配体的刺激作用丧失。缺少CpG基序的单链寡核苷酸(“非CpGssON”)未显示出TLR9介导的免疫刺激作用。单链DNA寡核苷酸(ssON)在人类单核细胞衍生的树突状细胞和在食蟹猴体内抑制TLR3介导的应答(等人，2012.Blood120:768-777)。TLR3是识别双链RNA并且启动针对病毒感染的免疫应答的关键受体。等人显示，在用合成的TLR3配体聚肌苷-聚胞苷酸(Poly(I:C))处理时，人类单核细胞衍生的树突状细胞上调成熟标志物并分泌促炎性细胞因子。Poly(I:C)是针对TLR3的合成激动剂，并且通常被用作疫苗的佐剂(参见例如Duthie,M.S.等人，2011.Immunol.Rev.239(1):178-196)。等人报道，在使用ssON的培养物中，TLR3介导的事件被抑制，同样非造血细胞的Poly(I:C)活化也被抑制。在ssON的存在下，Poly(I:C)到细胞中的摄取减少，阻止了TLR3接合的发生。在食蟹猴中，当通过鼻内途径施用ssON时，鼻分泌物中促炎性细胞因子的水平减少。因此，根据等人的研究，用ssON处理可以导致哺乳动物中细胞因子水平的显著变化。等人使用的ssON序列是：5’-GTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGTTGGTGGTGGTG-3’(CpGssON；SEQIDNO:25)；和5’-GAAGTTTTGAGGTTTTGAAGTTGTTGGTGGTGGTG-3’(非CpGssON；SEQIDNO:1)。本专利技术人已经显示(WO2016/202779)非CpGssON，诸如示出为SEQIDNO:1的非CpGssON，在治疗或预防皮肤和/或皮下组织的紊乱，包括瘙痒症中有用。对皮肤活组织检查物的转录谱分析揭示了猕猴中dsRNA(Poly(I:C))诱导的促炎性应答的ssON依赖性的选择性阻抑。通过对来自皮肤活组织检查物进行离体直接蛋白分析证实了ssON调节的细胞因子模式，并且揭示了IL-10的诱导和IL-6分泌的抑制。这进一步证明，当被施用至哺乳动物时，ssON可以产生细胞因子产生的显著差异。Baharom,F.等人(J.Immunol.194:4422-4430)报道了脂多糖或Poly(I:C)对单核细胞衍生的树突状细胞的刺激导致I型IFN诱导并且减少对A型流感病毒感染的易感性。这些结果暗示，能够减少Poly(I:C)刺激的作用的ssON将增加对病毒感染诸如流感病毒感染的易感性。在临床前模型中已经开发并研究了能够下调免疫系统细胞元件的合成的寡脱氧核苷酸。这些剂在序列、作用机制和细胞靶方面不同，但通常对它们的作用机制缺乏了解(Bayik，D.等人，2016.PharmacolRes.105:216-225)。例如，已经显示(Gursel,I.等人，2003.JImmunol.171(3):1393-1400)哺乳动物端粒中以高频率存在的重复元件，诸如TTAGGG，下调了CpG诱导的免疫活化。Hanecak等人(US2011/0124715)公开了用于抑制病毒活性的化学修饰的寡核苷酸。该修饰的寡核苷酸具有不多于27个核酸碱基单元，并且包含至少一个GGGG序列或至少两个GGG序列。Vaillant等人(US2012/0184601)公开了具有抗病毒活性的随机序列寡核苷酸。公开了可以通过ssON体外抑制一组病毒，该组病毒限于HSV-1、HSV-2、CMV、柯萨奇B2病毒、DHBV、汉坦病毒、副流感病毒、HIV-1和痘苗病毒。认为对于其中病毒基因组的组装和/或包装和/或包壳是复制中所需步骤的病毒，随机ssON具有广谱抗病毒活性。然而，作者还指出，虽然他们可以通过使用ssON抑制RSV，但他们未能抑制病毒诸如A型流感病毒(H3N2)、冠状病毒(HCoV-OC43)、BVDV、鼻病毒(HGP)和腺病毒(人类Ad5)。WO2006/042418中描述了其他ssON。总之，在治疗不同病毒感染中有用的单链寡核苷酸的结构和机制仍不清楚。本专利技术人现已发现ssON抑制胞吞作用(endocytosis)，并且从而抑制流感病毒感染。如在实施例1中示出的，发现ssON抑制人类单核细胞衍生细胞(moDC)中的一些胞吞途径，而不影响其他途径。这些研究揭示了细胞外ssON在Toll样受体(TLR)配体的胞吞摄取中的调节作用，并为它们的免疫调节提供了机制解释。在实施例2中，树突状细胞用ssON预处理，并且然后暴露于A型流感病毒(IAV)。与未处理的树突状细胞相比，病毒载量明显且高度显著地减少。此外，如在实施例3中示出的，当给予ssON作为预防性处理或在流感病毒攻击后三天给予ssON作为治疗性处理后，小鼠中的病毒载量显著减少。实施例4显示出，在A型流感病毒感染的小鼠中发生病毒载量减少而细胞因子反应没有显著变化。不希望受任何理论本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单链寡核苷酸(ssON)，所述单链寡核苷酸(ssON)用于在预防或治疗受试者的流感病毒感染中使用，/n其中所述单链寡核苷酸是抑制胞吞作用的单链寡核苷酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170906 GB 1714330.61.一种单链寡核苷酸(ssON)，所述单链寡核苷酸(ssON)用于在预防或治疗受试者的流感病毒感染中使用，
其中所述单链寡核苷酸是抑制胞吞作用的单链寡核苷酸。


2.根据权利要求1所述的用于使用的ssON，其中所述ssON是抑制网格蛋白介导的胞吞作用和/或小窝蛋白依赖性胞吞作用的ssON。


3.根据权利要求1或2所述的用于使用的ssON，其中所述ssON是调节Toll样受体信号传导的ssON，优选地，其中所述ssON是抑制TLR3信号传导的ssON。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON抑制胞吞作用，并且从而防止流感病毒进入细胞中。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON的长度为至少25个核苷酸。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的用于使用的ssON，其中(i)所述ssON中至少90％的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键；或(ii)所述ssON包含至少4个硫代磷酸酯核苷酸间键和至少4个2’-O-甲基修饰。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON不包含CpG基序。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的用于使用的ssON，其中：
(a)所述ssON的长度为至少25个核苷酸；
(b)(i)所述ssON中至少90％的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键；或(ii)所述ssON包含至少4个硫代磷酸酯核苷酸间键和至少4个2’-O-甲基修饰；以及
(c)所述ssON不包含任何CpG基序。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON包含至少6个硫代磷酸酯核苷酸间键和至少6个2’-O-甲基修饰。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON中的所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯核苷酸间键。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON的长度为20个和70个核苷酸之间或25个和70个核苷酸之间。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON的长度为28个和70个核苷酸之间。


13.根据权利要求1-10中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON的长度为25个和35个核苷酸之间。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON中不多于16个连续核苷酸与任何人类mRNA序列互补。


15.根据权利要求1-14中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON不是自身互补的。


16.根据权利要求1-15中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON中的单糖选自由2’-脱氧核糖和2’-O-甲基核糖组成的组。


17.根据权利要求1-16中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON不与流感特异性基因或多肽结合。


18.根据权利要求1-17中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON不包含TTAGGG。


19.根据权利要求1-18中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON不包含至少一个GGGG序列和/或不包含至少一个GGG序列。


20.根据权利要求1-19中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON包含至少3个不同的选自由A、C、G和T组成的组的核苷酸，或至少4个不同的选自由A、C、G和T组成的组的核苷酸。


21.根据权利要求1-20中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON包含具有表1中列出的SEQIDNO:1-24中的任一序列或其互补序列的多核苷酸或由该多核苷酸组成，任选地其中所述ssON包含具有SEQIDNO:1、3、4、7、8、10、11、13-22和24中的任一序列或其互补序列的多核苷酸或由该多核苷酸组成。


22.根据权利要求1-21中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON包含具有与表1中列出的SEQIDNO:1-24中的任一序列或其互补序列共有至少60％序列同一性的序列的多核苷酸或由该多核苷酸组成。


23.根据权利要求1-22中任一项所述的用于使用的ssON，其中所述ssON包含具有表1中列出的SEQIDNO:1-24中的任一序列或其互补序列的多核苷酸或由该多核苷酸组成，其中多达10个核苷酸被另一个核苷酸取代。


24.ssON在制备用于预防或治疗受试者的流感病毒感染的药物中的用途，
其中所述ssON是抑制胞吞作用的ssON。


25.一种用于预防或治疗受试者的流感病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用ssON，
其中所述ssON是抑制胞吞作用的ssON。


26.根据权利要求24所述的用途或根据权利要求25所述的方法，其中所述ssON如权利要求1-23的任一项中所定义的。


27.根据权利要求1-24和26中任一项所述的用于使用的ssON，或根据权利要求25或26所述的方法，其中所述流感病毒是A型流感病毒。


28.根据权利要求1-24、26和27中任一项所述的用于使用的ssON，或根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·约尔弗，安娜莉娜·玛丽·斯佩兹，亚历山德拉·玛利亚·顿达尔斯卡，
申请(专利权)人：蒂尔梅德制药有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE