分子印迹聚合物、其制备方法和检测分析物存在的方法技术

本发明专利技术提供了整合有发射位点的蛋白质或多肽印记聚合物（ＰＩＰＩＥＳ），用于检测包含对分析物特异的模板位点的蛋白质或多肽分析物的存在。在模板位点上或其附近是选择性地放有报道分子。也公开了ＰＩＰＥＳ的制备方法及其在检测分析物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总地涉及分析物检测领域，更具体地涉及在样品中检测蛋白质。
技术介绍
美国人在检测和定量化学物质上每年花费数十亿美元。这些测定大部分在装备精良的实验室中进行，需要技术人员、大量昂贵试剂和长分析时间。用于临床点护理测试或野外应用时也需要小的整合分析平台。许多这些需要有助于激发化学传感器的开发。类似地，对同时测量样品中的“每种物质”的日益增长的需求促进了依赖于化学和生化传感器阵列策略的人造“鼻”和“舌”的开发。目前，需要开发克服现有装置和方法的缺点的新装置。在样品中同时定量多种分析物的检测方法是构建和操作更便宜且更简单的，它们精确、准确且可信，和/或提供足够的检出限和选择性，这或许是分析物检测领域中受欢迎的进展。试图用于检测的一种通用装置是“生物传感器”。在普通生物传感器中，固定的生物识别元件(如抗体、适体、DNA寡核苷酸、酶、凝集素、信号蛋白、转运蛋白)用于选择性识别靶分析物，结合或转化(如果分析物是底物)事件导致与样品中的分析物浓度相关的光学、质量、热和/或电化学反应。虽然生物传感器开发看起来好像简单，但是有许多基础问题与开发分析上有用的生物传感器有关。例如，传统方案取决于鉴定合适的可选择性识别靶分析物的生物识别元件。采用合适的检测/转导方法，固定生物识别元件，以使它保持其天然活性/亲和性和选择性。生物识别元件-传统设计中的生物传感器的心脏-需要随时间保持稳定，靶分析物需要进入生物识别元件，在每次测量后需要分析物-生物识别元件结合/相互作用是可逆的，或至少容易解离/复位。上述缺点限制了生物传感器在分析物检测中的应用。在过去十年中，通过模板-导向的功能性单体的交联在合成聚合物内引入特定结合域引起了很大关注。分子印记包括将可聚合功能性单体排列在模板(假靶分析物或实际靶分析物)周围，然后聚合和去除模板。该排列一般通过以下作用来实现(i)非共价相互作用(如H键、离子对相互作用)或(ii)可逆共价相互作用。去除模板后，这些分子印记的聚合物(MIP)可识别和结合特定化学物质(即模板或模板类似物)。基于MIP的材料的潜在优点包括与生物识别元件相当的特异性；在极端化学和物理条件下的坚固性和稳定性；以及为缺少合适的生物识别元件的分析物设计识别位点的能力。开发了用于(非穷举列表)蛋白质、氨基酸衍生物，糖及其衍生物、维生素、核苷酸碱基、杀虫剂、药品和聚环芳香烃的MIP。然而，根据Lam，开发基于MIP的生物模拟传感器中主要问题之一是信号转导。有几则报道利用发光作为转导形式的基于MIP的传感器。例如，Powell小组用反式4--N-乙烯基苄基氯化嘧啶(荧光团)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、2-羟乙基甲基丙烯酸酯和引发剂2，2′-偶氮二异丁酸腈(AIBN)形成cAMP印记的有机聚合物。这些MIP在1毫摩尔cAMP的存在下荧光改变20％，它们对于cAMP的选择性超过cGMP。Murray小组用Eu(R)3(NO3)3(R＝频哪基甲基磷酸酯或二乙烯基甲基苯甲酸酯)(荧光团)、苯乙烯和AIBN制备索曼印记的有机聚合物。这些MIP能够检测低至每1×1015份之750份的索曼且来自有机磷农药的干扰最小。传感器反应时间是8分钟。Takeuchi小组报道了基于荧光的MIP传感器，用于检测9-乙基腺嘌啉(9-EA)。此传感器基于用5，10，15-三(4-异丙基苯基)-20-(4-甲基丙烯酰基氧苯基)卟啉锌(II)(荧光团)和甲基丙烯酸模板9-EA。在CH2Cl2中，这些聚合物对9-EA的结合亲和力为7.5×105M-1，对腺嘌啉、4-氨基吡啶和2-氨基吡啶有选择性，在250微摩尔9-EA的存在下产生的荧光改变为40％。Wang小组报道了基于荧光的MIP传感器，用于用丹磺酰化的二甲基丙烯酸单体(荧光团)、乙二醇二甲基丙烯酸酯和AIBN检测L-色氨酸。在操作中，作者将移动淬灭剂4-硝基苯甲醛(4-NB)加入MIP，使丹磺酰发射淬灭。加入L-色氨酸后，释放/阻断一些4-NB进入丹磺酰残基，丹磺酰荧光增加。加入10毫摩尔L-色氨酸后荧光改变为45％。等量D-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-丙氨酸的存在引起32％、27％和＜9％荧光改变。Lam小组用光诱导的电子转移(PET)方案形成基于荧光的MIP，用于检测模板的溶胶凝胶衍生的干凝胶内的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。在此项工作中，作者用2，4-D作为模板使3-丙基三乙氧基硅烷(荧光团)与四乙氧基硅烷(TEOS)和苯基三甲氧基硅烷(PtrMES)共聚合。如此形成的MIP随pH(表观pKa在7.2附近)显示荧光改变，它在750微摩尔2，4-D的存在下产生15％荧光降低。用苯甲酸和乙酸进行的测试在相似浓度时不引起显著干扰。近来，Edmiston和同事报道了用于以牺牲间隔(SS)方案检测杀虫剂1，1-双(4-氯代苯基)2，2，2-三氯乙烷(DDT)的基于荧光的干凝胶MIP的制作方法，其中他们将3-异氰基丙基三乙氧基硅烷与4，4′-亚乙基双酚反应，形成SS。然后他们通过将3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)与荧光团4-氯-7-硝基苯并呋咱(NBD)反应(将NBD连接于APTES胺，NBD-APTES)制备荧光单体。然后通过混合NBD-APTES、SS和双(三甲氧基甲硅烷基)苯，然后经一般的酸水解方法形成印记干凝胶。一旦干凝胶形成，作者用稀释的LiAlH4切割SS氨基甲酸酯键，在模板位点内形成胺残基，从干凝胶中释放SS。传感器对DDT起反应(NBD荧光改变3％)，模板干凝胶对DDT提供的选择性超过可能的干扰物(如蒽(A)、2，2-双(4-氯代苯基)-1，1-二氯乙烯(p，p-DDE)、1-(2-氯代苯基)-1-(4-氯代苯基)-2，2-二氯乙烷(o，p-DDD)、2，2-双(4-氯代苯基)-1，1-二氯乙烷(p，p-DDD)、二苯基甲烷(DPM)、4，4′-二溴联苯基(DBBP)、4，4′-双(氯甲基)-1，1′-联苯基(BCP))。DDT检出限在每十亿水平单位数部分。然而，在所有以前有关基于发光的MIP传感器的工作中，没有开发出保证在分析物结合发生时发光报道分子实际上紧挨着分析物的方案。专利技术概述本专利技术提供分子印记聚合物及其用于选择性检测蛋白质和多肽的方法。制备分子印记聚合物的方法包括制备整合有发射位点的蛋白质或多肽模板的聚合物(PIPIES)，这意味着报道分子选择性植入模板位点中或其附近。为了检测测试样品中存在的蛋白质或多肽，使测试样品接触PIPIES，以使靶蛋白或多肽(如果存在)与PIPIES结合/反应。传感器反应可用任何光子检测装置如光电倍增管、电荷转移装置(CTD)或互补型金属氧化物半导体(CMOS)来检测。通过首先在靶蛋白周围形成聚合物平台产生本专利技术PIPIES。然后从聚合物平台上去除蛋白质分子，产生模板位点。然后用一个或多个报道分子选择性标记模板位点，如下所述。报道分子共价连接于可活化的化学残基，形成可活化报道物。报道分子可直接或通过插入化学部分链(tether)基团和/或接头基团连接于可活化的化学残基。报道分子和可活化的化学残基与或不与链基团和/或接头基团的组合称为可活化报道物(AR)。然后，使可活化报道物结合于靶蛋白(或多肽)分子，形成非共价键合的靶蛋白-AR复合物。这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测选自蛋白质或肽的分析物存在的含有聚合物基质的分子印记聚合物，所述聚合物基质包含：多个模板位点，各模板位点对分析物特异；和一个或多个报道分子，其选择性连接在模板位点上或其附近，以致特定多肽或蛋白质结合于模板位点后，观察到报道物的吸光度和／或发射改变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：FV布莱特，
申请(专利权)人：纽约州立大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[]