出于医学诊断目的而测定内皮素形成的方法,以及用于实施所述方法的抗体和试剂盒技术

本发明专利技术涉及在严重疾病的情况下，特别是在心血管疾病、炎症、败血症和癌症的情况下，出于医学诊断目的而测定人类患者的全血、血浆或血清中的内皮素形成的体外方法，在该方法中，测定经加工的原初前内皮素原或内皮素原的相对长寿的肽片段，特别是Ｃ－末端肽片段，所述肽片段既不包含真正的具有生物活性的内皮素，也不包含其直接的前体，即大内皮素。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,以及用于实施所述方法的抗体和试剂盒的制作方法
本专利技术涉及出于医学诊断目的在严重疾病的情况下通过测定循环(全血、血浆或血清)中的相应的内皮素原的肽片段，特别是前内皮素原-1的相对长寿的C-末端部分肽，来测定内皮素的形成，更确切地说，特别是在败血症诊断、心脏病诊断中，例如还在癌症诊断中，更准确地说通常在其中内皮素对于疾病的过程起着重要作用的这样的病状的诊断中。当在本申请中简单地使用“内皮素”时，这一术语首先表示内皮素-1(ET-1)。但是，相应的表述对于内皮素的其他同种型常常也是通用的，因为限制为内皮素-1似乎通常不是必需的，从广义上来说，本专利技术还应当涉及其他的内皮素。在本说明书中，术语“诊断”在此原则上作为简化的上位术语进行使用，其特别应当还包括预后/早期预后和与治疗相伴的过程控制。特别地，借助于特异性免疫诊断学方法，尤其是借助于一类其中使用至少一种标记的抗体的免疫测定法(三明治测定法；竞争测定法，例如根据SPALT或SPART-原理)，来进行所述测定。内皮素-1(ET-1)是一种含有21个氨基酸的肽，其是已知最强的血管收缩剂。自从其在1988年被Yanagisawa及其同事发现以来，已经广泛地研究了其生物合成、作用方式和与疾病的关联，并概括在专题性的综述文章中。存在三种由不同的基因编码的内皮素同种型(内皮素-1、内皮素-2、内皮素-3)，其中内皮素-1的浓度最大且最有效。内皮素-1在内皮细胞、肺、心、肾和脑中合成。人内皮素-1基因的初始的翻译产物是含有212个氨基酸的肽，即前内皮素原-1(SEQ ID NO1)。在分泌过程中，由信号肽酶切除前内皮素原的短的N-末端信号序列(第1-17位氨基酸)。随后，在此获得的内皮素原由作用于双碱性氨基酸对的蛋白酶即弗林蛋白酶加工成没有生物活性的、含有38个氨基酸的肽，即大内皮素(big-Endothelin)(SEQ ID NO3)，由此最后借助于内皮素转化酶(ECE)形成成熟的、具有生物活性的内皮素-1(SEQ ID NO2)。内皮素通过与位于肌细胞、心肌细胞和成纤维细胞上的特异性受体结合而发挥作用。这种结合导致钙的流出、磷脂酶C的活化和Na/K ATP酶的抑制。除了血管收缩作用之外，内皮素还具有生长调节特性。鉴于内皮素(特别是内皮素-1)的可检测的和推测中的大量和重大的生理学作用，自从鉴定出其的那时候开始，就已经开发出了多种不同的测定法以用于其免疫诊断测定，并将这些测定法用于测量内皮素，特别是在人血浆中。这样的测定是许多公开文献的主题。对于多种疾病病状，已经描述了内皮素-1和大内皮素的血浆浓度升高。属于此的疾病为心血管疾病(尤其是肺动脉高压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、心肌梗塞)、败血症和感染性休克、癌症，等等。用于测量血浆样品中的内皮素的免疫测定法(参见中的综述)特别属于放射免疫测定法的类型(使用标记的内皮素-1作为竞争者)，或者属于EIA/ELISA类型，而且这些方法仅仅旨在测定内皮素或者测定内皮素-免疫反应性。在此，RIA类型的测定法具有较低的特异性，并还包括了含有内皮素序列的相关肽。但是，发现内皮素-1(ET-1)具有极短的在循环中的停留时间，在1-2分钟之后其就已经从循环中被清除。由于认为在血液和血浆中的内皮素-1是稳定的，所以其分配入其他组织中以及其快速和高亲和力地与受体结合被看作是短的停留时间的最重要原因。因此，在某些组织和体液中，能够测得比例如在血浆中明显更高的内皮素-1浓度。鉴于这些情况，测定血浆样品中的ET-1的正确性受到了严重的质疑。也就是说，认为对于内皮素(ET-1)的生理作用来说，在血浆样品中可测定的短暂的(也许只是反映了过渡状态的)ET-1浓度是不重要的，然而所有在生物体中存在的游离的和结合的(例如与组织和受体结合的)生理ET-1浓度的总和则具有大得多的相关性。相对于测定ET-1来说，测定ET-1前体即所谓的大内皮素(“bigET-1”；SEQ ID NO3)具有优点，即“大内皮素”在循环中的停留时间比从其释放的ET-1的停留时间明显更长。因此，在一系列的研究中，没有测定真正的内皮素，而是测定了该“大内皮素”。特别地，使用三明治型的测定法用于其特异的测定，所述三明治型的测定法使得能够可靠地区分大内皮素-1与经加工的ET-1和其他内皮素。显示出，在某些疾病的情况下，测量出ET-免疫反应性升高可归因于大内皮素。选择性地测量大内皮素-1只是问题的逐渐改善，而没有实际解决问题，因为大内皮素也能够在血液循环中快速地被加工成内皮素。因此，其同样也具有相对较短的生物半寿期(20-25分钟)，因而在血浆中可测定的大内皮素的测量值同样也只是代表了短暂的血浆浓度，而没有反映真正起生理作用的内皮素浓度。当测定大内皮素-1时，在疾病条件下生理形成的、但已经经过加工的并结合在组织中或受体上的ET-1是不包括在内的。因此，在测量大内皮素的情况下，也低估了具有生理活性的内皮素的总量。尝试了补充地特异性测量在大内皮素-1的酶促裂解时除了ET-1之外而形成的大内皮素-1的C-末端肽片段(具有前内皮素原的第74-90位氨基酸或大内皮素的第22-38位氨基酸)，结果表明这样的肽的稳定性比ET-1还要差，因而不适合于测量。对于测量除了大内皮素之外的内皮素原的范围，从现有技术中仅获知一种商业的竞争性测试法(N-末端区域18-50，从PhoenixPharmaceuticals商购获得；对于败血症诊断的用途描述在WO00/22439中)。对于待用这种测定法进行测量的分析物的稳定性和性质，没有公开任何信息。本专利技术的目标是开发出一种测定方法，该方法能够比迄今的对于血浆中的ET或大内皮素的测定更可靠地反映大内皮素或内皮素的内源形成，即总的生理浓度，和由此反映内皮素的作用。一种这样的方法应当是有效的和适于程式化的，并能够提供在各种不同的疾病状况的情况下关于ET(ET-1)和/或其前体的生理产生的可靠值，特别是在败血症或其他其中内皮素的值升高起着作用的疾病状况的情况下。本专利技术的目标通过如此来达到，即出于诊断目的，在人类患者的全血、血浆或血清样品中不测定ET或大内皮素，而是测定不含有ET或大内皮素序列的相对长寿的前内皮素原-或内皮素原-部分肽，特别是C-末端部分肽，其至少含有前内皮素原-1的第168-212位氨基酸。权利要求1涉及本专利技术的原理。本专利技术有利的并且目前优选的实施方案描述在从属权利要求中。本专利技术基于申请人的实验研究，在这些实验研究中能够表明，前内皮素原的这样的部分不是内皮素的直接的前体，其包括适合于测量目的的长寿的肽，这些长寿的肽能够在血液样品中可靠地和以高临床价值得到测量。在生理学上，内皮素-1通过更大的前体分子即前内皮素原(SEQ IDNO1)或者从中获得的分泌的内皮素原的加工而形成。在这样的加工过程中，除了大内皮素(和从中而来的内皮素)之外，必须以初始化学计算量形成其他的肽，这些肽迄今仍然从未成为科学研究的对象，并且关于其可能的其他加工和稳定性是未知的。在申请人的研究开始时，希望能够证实，血液样品(全血、血浆或血清样品)中存在至少一种假设的其他的肽-裂解产物，并经证明是相对稳定的，因而可以适合于作为内皮素的生理形成的量度，而不管实际的在血浆中可测得本文档来自技高网...

【技术保护点】
在严重疾病的情况下，特别是在心血管疾病、炎症、败血症和癌症的情况下，出于医学诊断目的而测定人类患者的全血、血浆或血清中的内皮素形成的体外方法，其特征在于，测量内皮素－１（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２）和大内皮素－１（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３）的形成，方法是测定前内皮素原－１（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１）的这样的Ｃ－末端片段，其被与相应于前内皮素原－１的第９３－２１２位氨基酸范围内的肽序列的肽相结合的抗体识别。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A贝格曼，J施图克，
申请(专利权)人：BRAHMS股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]