细菌毒力因子及其用途制造技术

本发明专利技术部分地涉及细菌病原体的分泌蛋白及其使用方法。更特别地，本发明专利技术部分地提供了若干种新的针对Ａ／Ｅ病原体的常见分泌蛋白。在本发明专利技术的某些实施方案中，这些多肽和编码这些多肽或其部分的核酸分子可用作针对Ａ／Ｅ病原性感染的有效疫苗、诊断学或药物诊断工具或用作试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细菌病原体。更特别地，本专利技术部分涉及细菌病原体的分泌蛋白及其使用方法。
技术介绍
大肠杆菌(Escherichia coli)是多样性极高的有机体。除了是正常的肠道菌群之外，E.coli的菌株还可引起膀胱感染，脑膜炎和腹泻。肠出血性(Enterohemorrhagic)E.coli包括至少5种E.coli，其能引起从类似霍乱的腹泻到极端大肠炎的多种症状。每种肠出血性E.coli都具有一套包括粘合素，侵袭素和/或毒素的特异性毒力因子，其负责引起特异性的腹泻。致肠病性(Enteropathogenic)E.coli(EPEC)是世界范围内婴儿腹泻的最主要原因。EPEC疾病的特征是严重程度不同的水样腹泻，以及呕吐和通常伴随脱水的发烧。除了在发达国家的日间看护和托儿所中孤立的爆发之外，EPEC在发展中国家对婴幼儿(＜6个月)也是一种主要的地方病健康威胁。在世界范围内，EPEC是婴幼儿中最主要的细菌介导性腹泻的原因，据估计EPEC每天可使数十万儿童致死。肠出血性E.coli(EHEC)，也称为产志贺氏毒素的E.coli(STEC)或产细胞毒素的E.coli(VTEC)，能引起比EPEC(肠性大肠炎)更严重的腹泻，且约占10％的病例，该疾病还可演变成常见的致死性肾脏疾病，溶血性尿毒症综合征(HUS)。EHEC O157:H7是加拿大和美国最常见的血清型，并且与食物和水中毒有关(3)。其他血清型的EHEC也在亚洲、欧洲和南美洲引起了一些更为严重的问题，而北美洲的严重情况略差。EHEC寄居于牛并引起A/E损伤，但在成年动物中并不引起疾病，相反却将有机体扩散至环境中。由于相对稀少的EHEC就足以感染人类，所以这会引起严重的健康问题。与诸如肠毒素性(enterotoxigenic)E.coli的其他E.coli腹泻不同，由EHEC和EPEC引起的腹泻并不是由毒素介导的。相反，EPEC和EHEC结合于肠表面(EPEC结合于小肠，EHEC结合于大肠)并引起了特征性的组织损伤，成为附着和消失(A/E)损伤(8)。A/E损伤的特点在于在细菌附着位置上肠刷状缘表面的溶解和上皮微绒毛的丧失(消失)。一旦发生结合，细菌就位于类似杯状的突出物或基架上。在上皮细胞中支撑这一基架的是几种细胞骨架成分，包括肌动蛋白和与肌动蛋白相连的细胞骨架蛋白。A/E损伤的形成和在附着细菌下方的富含肌动蛋白的基架是A/E病原体的组织病理学标志(1，2)。该病理学可在体外培养的细胞中重现，且基架形成也可通过荧光肌动蛋白染色分析得以观察(2，11)。A/E损伤的形成可能是破坏所述刷状缘和微绒毛，流体分泌以及腹泻的原因。EPEC和EHEC属于A/E病原体家族，其包括若干种在兔子(REPEC)，猪(PEPEC)和小鼠(Citrobacter rodentium(肠粘膜肥厚症菌))中引起疾病的EPEC样动物病原体。这些病原体包括致病岛(PAI)，其编码特异性的分泌系统并分泌对疾病至关重要的毒力因子。一般认为形成A/E损伤的基因在单染色体致病岛中是成簇分布的，称为肠上皮细胞消失座位(LEE)，其包括III型分泌系统(TTSS)，分泌的效应蛋白及其同源的伴侣蛋白(4-8)。所述LEE包括41个基因，使其成为更复杂的PAI。所述LEE TTSS的主要功能是将效应物传递入宿主细胞中，在那里其破坏宿主细胞功能并介导疾病(9，10，34)。现已鉴定了5种LEE编码的效应物(Tir，EspG，EspF，Map和EspH)(35-40)。(针对易位紧密粘附素(intimin)受体的)Tir被易位入宿主细胞中，在那里其与宿主细胞骨架蛋白和信号蛋白结合，并在细菌附着位点启动了肌动蛋白聚合(31，44)，导致了在附着细菌下方形成了肌动蛋白基架结构，其通过细菌外膜蛋白紧密粘附素与Tir的细胞外环直接作用。CesT作为Tir稳定和分泌的伴侣蛋白发挥作用(18，19)。还对A/E病原体中的四种其他LEE编码的TTSS易位效应物进行了表征EspH增强了肌动蛋白基架的延伸(40)；EspF在分解肠上皮细胞的紧密联合中具有作用(38)；EspG与志贺杆菌微管结合效应物VirA相关(36，55)；Map位于线粒体(37)，还具有肌动蛋白动力学的作用(48)。(针对LEE编码的调节子的)Ler是目前已鉴定的仅有的LEE编码的调节子。专利技术概述本专利技术部分根据的是对A/E病原体的几种新普通分泌蛋白的鉴定。在一方面，本专利技术提供了包括多肽或其片段或变异体，或包括这种多肽的细胞培养上清液的组合物，其中基本上纯的所述多肽包括与SEQID NO22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任意一种或多种序列基本上相同的氨基酸序列。本专利技术还提供了包括核酸分子的组合物，其中所述核酸分子包括与SEQ ID NO1-21或60-72的任意一种或多种序列基本上相同的核酸序列；以及包括核酸分子的组合物，其中所述核酸分子编码与SEQ ID NO22-43，或其片段的任意一种或多种序列基本上相同的多肽序列。所述组合物还包括生理可接受的载体，或还包括佐剂。所述组合物还包括多肽或核酸分子，例如EspA，EspB，EspD，EspP，Tir，志贺氏毒素1，志贺氏毒素2或紧密粘附素。所述多肽或核酸分子可能是基本上纯的。在其他方面，本专利技术还提供了细菌或其制备方法，其中所述细菌在诸如nleA，nleB，nleC，nleD，nleE，nleF，nleG或nleH或其同源物的基因上有突变，或在其基因组上在与SEQ ID NO1-21或60-72基本上相同的核酸序列上有突变。在一些实施方案中，所述细菌可以是A/E病原体，例如肠出血性E.coli(EHEC；例如EHEC O157:H7或EHECO157:NM)，致肠病性E.coli(EPEC；例如EPEC O127:H6)或Citrobacterrodentium(肠粘膜肥厚症菌)。在某些实施方案中，所述突变可以减弱毒力，或者所述突变可发生在所述A/E病原体的基因组核酸序列中，所述核酸序列与选自SEQ ID NO1-21或60-72的序列基本上相同。所述细菌可与佐剂一起作为组合物提供。在某些实施方案中，所述细菌可以是活的。在某些实施方案中，所述细菌可以是死的。给药方式可以是口服或经肠道外给药。在其他方面，本专利技术还提供了在样本中测定A/E病原体存在的方法，所述方法是通过，提供样本；以及测定以下物质的存在包括与选自SEQID NO1-21或60-72或其片段或变异体中的任意一种或多种序列基本上相同的核酸序列的核酸序列；编码与选自SEQ ID NO22-43、59或73-84，或其片段或变异体的序列基本上相同的多肽序列的核酸序列，或者包括与选自SEQ ID NO22-43、59或73-84，或其片段或变异体的序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子或多肽的存在说明在所述样本中(例如蛋、粪便、血液或肠)存在有A/E病原体。所述测定包括用与选自SEQ ID NO1-21或60-72的序列基本上相同的探针或引物，或编码与SEQ ID NO22-43、59或73-84，或其部分基本上相同的多肽的核酸序列接触所述核酸序列，或者所述方法包括用抗体接触所述氨基酸序列，所述抗体特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括多肽与生理可接受的载体的组合物，所述多肽包括与ＳＥＱＩＤＮＯ：２２－４３、５９或７３－８４，或其片段或变异体的序列基本上相同的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：布雷特芬蕾，萨玛莎古恩海德，邓万银，布鲁斯瓦兰斯，何塞L普恩特，
申请(专利权)人：不列颠哥伦比亚大学，墨西哥国家自治大学，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]