一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法技术

一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法，属于食品检测技术领域。从上至下，依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板和印刷有方格的底板三部分组成；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水可溶性凝胶粉末；塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与塑料中层板面积的比例范围为1:1.6～2.7，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基的灭菌无纺布。霉菌和酵母利用测试片中荧光/显色底物水解后释放的发色基团呈色，该测试片既能在365nm紫外灯下进行荧光菌落计数，也能够在可见光条件下进行菌落计数。

【技术实现步骤摘要】
一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法。
技术介绍
霉菌和酵母计数测定指标是反映食品质量卫生安全的重要指标，用来判定食品受污染的程度。霉菌和酵母计数检测是各类食品重要的检测项目。目前GB4789.15-2016食品安全国家标准《食品微生物学检验-霉菌和酵母计数》，采用琼脂平皿计数法。该方法检测程序繁琐，检测消耗时间较长，难以满足食品质量卫生现场监测检测结果的时效性。微生物计数测试片类检测产品省去了配制培养基、消毒灭菌和培养器皿的清洗处理等大量辅助性工作，计数便捷，只需要个简单的步骤样品制备、增殖培养和计数，是国内外进行微生物污染计数测定较为理想的检测产品。虽然现有的商业化微生物测试片检测产品具有方便实用的突出优势，但霉菌和酵母菌落计数测试片仍然存在一些关键技术瓶颈需解决。突出问题集中在计数准确性差；检测周期长，一般为48h～72h。
技术实现思路
本专利技术针对上述存在问题研制了一种用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片及制备方法。既能在365nm紫外灯下进行荧光菌落计数，又能在可见光条件下对显色菌落进行计数。本专利技术所述测试片采用复配显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP-2Na)和4-硝基苯棕榈酸酯(PNP-PAL)构成霉菌和酵母落计数测试片的显色系统；同时，在测试片培养基中加入荧光增敏剂——乙醇以及非离子表面活性剂Tween-80和TritonX-100，加速了霉菌和酵母菌落在测试片中呈色，其中荧光检测可在培养18h后进行菌落计数，无背景干扰；当培养30h后可在可见光下肉眼准确计数。该荧光/可见光双重检测测试片霉菌和酵母菌落呈色清晰、计数准确。本专利技术的目的之一在于提供一种操作简单、检测时间短、计数结果准确的霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片。该菌落计数测试片从上至下，依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板和印刷有方格的底板三部分组成；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水(温度范围是20～45℃)可溶性凝胶粉末；塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与塑料中层板面积的比例范围为1:1.6～2.7，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基的灭菌无纺布。复配冷水可溶性凝胶粉末是将经研磨后过10～150目标准筛的丙酮酸钠和瓜尔胶混合后得到，按丙酮酸钠和瓜尔胶的重量和100％计算，丙酮酸钠的重量百分含量为15～25％，其余为瓜尔胶。霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基的重量组份为：蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，无水乙醇4～40mL，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，Tween-801mL～3mL，TritonX-1001mL～3mL，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP-2Na)0.1～1.0g，4-硝基苯棕榈酸酯(PNP-PAL)0.1～1.0g，氯霉素0.05～0.2g和蒸馏水1000mL。以灭菌无纺布作为显色培养基的载体，其为密度50～80g/m2的水刺无纺布。透明塑料上层膜为透明度高、无毒无刺激性气味、防水透气的PET硅胶膜，厚度为0.05～0.10mm，PET硅胶膜的下表面自身带有粘性；带有镂空区域的塑料中层板为硬度较好且透明高的PP塑料板或PVC塑料板，厚度为0.15～0.30mm；印刷有方格的底板为防水、防渗透的白色铜版纸，厚度为0.10～0.20mm；方格的尺寸范围是(1～2)cm×(1～2)cm。以上材料耐高温的温度范围为130～150℃。本专利技术另一个目的是提供上述霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片的制备方法，其步骤如下：(1)霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基的制备称取蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，加入蒸馏水900mL搅拌溶解后，经121℃高温灭菌15～20min放置室温，得到液体培养基，冷却至室温；将氯霉素0.05～0.2g，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP-2Na)0.1～1.0g和4-硝基苯棕榈酸酯(PNP-PAL)0.1～1.0g加入100mL含有无水乙醇4～40mL，Tween-801mL～3mL，TritonX-1001mL～3mL的蒸馏水中，用孔径0.22μm的一次性过滤器过滤除菌后加入到灭菌后的液体培养基中，得到霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基；将灭菌无纺布充分浸泡在霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数培养基中，浸泡的时间为15～30min，再于无菌条件下20～45℃烘干，得到浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光显色培养基的灭菌无纺布；(2)复配冷水可溶性凝胶的制备将经研磨后过100～150目标准筛的丙酮酸钠和瓜尔胶混合，得到复配冷水可溶凝胶粉末，其中丙酮酸钠的重量百分含量为15～25％；(3)霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片的制备将透明塑料上层膜、塑料中层板和印刷有方格的底板剪裁成相同尺寸(长度9～12cm，宽度7～10cm)，用聚丙烯酸树脂压敏胶(透明、无毒、无味、无菌)将贴有标签的一侧封闭粘合，粘合宽度为4～6mm；将上述复配冷水可溶凝胶粉末均匀地涂在透明塑料上层膜的粘性下表面上，厚度为0.10～0.20mm；在塑料中层板镂空区域露出的底板上均匀涂覆聚丙烯酸树脂压敏胶，厚度为0.05～0.10mm，将浸渍有霉菌和酵母计数显色培养基的灭菌无纺布放在塑料中层板的镂空区域内并压实；进行真空包装，然后采用环氧乙烷灭菌法进行灭菌，从而得到用于霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片。(4)霉菌和酵母荧光/可见光双重菌落计数测试片法测定的操作步骤固体或半固体样品：称取25g样品(样品可以是米面制品、糕点类食品、坚果制品)，加入225mL无菌稀释液(蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液)，充分振摇或用拍击式均质器拍打1～2min，制成1:10的稀释匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品(样品可以是饮料)置于盛有225mL无菌稀释液(蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液)的容器或无菌均质袋中，充分振摇或用拍击式均质器拍打1～2min，制成1:10的稀释匀液。取1mL上述1:10的稀释匀液加入盛有9mL无菌稀释液的试管中，在漩涡混合器上混匀，得到1:100的稀释匀液；依次制备10倍梯度稀释匀液，得到不同稀释度的稀释匀液，备用。根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的稀释匀液，掀开霉菌和酵母计数测试片的透明塑料上层膜，取上述样品稀释匀液1mL加至中层浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光菌落计数显色检测培养基的灭菌无纺布上，使样品匀液均匀分布于整个培养区；将塑料上层膜缓缓落下，避免挤压，静置30s～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片，其特征在于：该菌落计数测试片从上至下，依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板和印刷有方格的底板三部分组成；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水可溶性凝胶粉末；塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与塑料中层板面积的比例范围为1：1.6～2.7，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基的灭菌无纺布；/n其中，复配冷水可溶性凝胶粉末是将经研磨后过10～150目标准筛的丙酮酸钠和瓜尔胶混合后得到，按丙酮酸钠和瓜尔胶的重量和100％计算，丙酮酸钠的重量百分含量为15～25％，其余为瓜尔胶；/n霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基由蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，无水乙醇4～40mL，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，Tween-80 1mL～3mL，TritonX-100 1mL～3mL，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐0.1～1.0g，4-硝基苯棕榈酸酯0.1～1.0g，氯霉素0.05～0.2g和蒸馏水1000mL组成。/n...

【技术特征摘要】
1.一种霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片，其特征在于：该菌落计数测试片从上至下，依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板和印刷有方格的底板三部分组成；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水可溶性凝胶粉末；塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与塑料中层板面积的比例范围为1：1.6～2.7，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基的灭菌无纺布；
其中，复配冷水可溶性凝胶粉末是将经研磨后过10～150目标准筛的丙酮酸钠和瓜尔胶混合后得到，按丙酮酸钠和瓜尔胶的重量和100％计算，丙酮酸钠的重量百分含量为15～25％，其余为瓜尔胶；
霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数显色培养基由蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，无水乙醇4～40mL，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，Tween-801mL～3mL，TritonX-1001mL～3mL，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐0.1～1.0g，4-硝基苯棕榈酸酯0.1～1.0g，氯霉素0.05～0.2g和蒸馏水1000mL组成。


2.如权利要求1所述的一种霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片，其特征在于：灭菌无纺布为厚度0.10～0.20mm、密度50～80g/m2的水刺无纺布。


3.如权利要求1所述的一种霉菌和酵母荧光/可见光双重检测的菌落计数测试片，其特征在于：透明塑料上层膜为PET硅胶膜，厚度为0.05～0.10mm，PET硅胶膜的下表面自身带有粘性；带有镂空区域的塑料中层板为PP塑料板或PVC塑料板，厚度为0.15～0.30mm；印刷有方格的底板为白色铜版纸，厚度为0.10～0.20mm；方格的尺寸范围是(1～2)cm×(1～2)cm。


4.权利要求1～3任何一项所述的霉菌和酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈萍，徐琳琳，王蕾，孙博，孙雯，王思琪，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22