一种蛋白质凝胶内酶解的方法技术

本发明专利技术公开了一种蛋白质凝胶内酶解的方法。该方法包括下述步骤：１）将含有目标蛋白的凝胶用超纯水洗涤；将凝胶脱水，干燥；２）将干燥后的凝胶用酸化过的胰蛋白酶工作液浸泡０．５－１．５ｈ后，吸去多余酶工作液；所述酸化过的胰蛋白酶工作液是用８０－１２０ｍＭ盐酸溶解胰蛋白酶，酸化８－１２分钟，再用ＮＨ↓［４］ＨＣＯ↓［３］将ｐＨ值调节至８．０－９．０得到的溶液；３）加入含有Ｃａ↑［２＋］的缓冲液，３７℃酶解１４－１８ｈ，去除凝胶得到蛋白酶解液。本发明专利技术的方法在降低操作难度、简化实验步骤、降低成本的同时，能够有效提高了酶解效率，获得更多肽段信息，得到更高的数据库搜索分值，显著提高序列覆盖率，最终取得了更好的质谱鉴定结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种适用于质谱分析的蛋白质胶内酶解的方法。
技术介绍
随着大规模生物基因组测序工作的完成，人类已经进入了蛋白质组时代。目前在蛋白质组研究中，质谱(MS)技术是最核心的蛋白质鉴定技术(Cánovas F M，ElianeD G，Recorbet G，Jorrin J，Mock H P and Rossignol M.Plant proteome analysis.Proteomics，2004，4285-298；Chen S and Harmon A C.Advances in plantproteomics.Proteomics，2006，65504-5516)。根据离子化方法的不同，质谱主要分为基质辅助激光解吸电离飞行质谱(Matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight，MALDI TOF)和电喷雾电离飞行质谱(Electrospray ionization time-of-flight，ESI-TOF)两大类型(Cánovas F M，Eliane D G，Recorbet G，Jorrin J，Mock H P and Rossignol M.Plant proteomeanalysis.Proteomics，2004，4285-298)。通常是通过双向电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)将蛋白质混合物进行分离，切取目标蛋白点，用胰蛋白酶(trypsin)进行胶内酶解，然后进行质谱分析，得到肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting，PMF)，最终既可以直接根据PMF数据搜库鉴定出目标蛋白，也可以进一步通过二级质谱获得部分肽段序列后搜库，得到更为可靠的鉴定结果(Cánovas F M，El iane D G，Recorbet G，Jorrin J，Mock H P andRossignol M.Plant proteome analysis.Proteomics，2004，4285-298；RossignolM，Peltier J B，Mock H P，Matros A，Maldonado A M，Jorrin J V.Plant proteomeanalysisA 2004-2006 update.Proteomics，2006，65529-5548)。无论哪种质谱鉴定技术，蛋白质胶内酶解都是至关重要的一步。目标蛋白酶解是否完全、酶切位点是否特异、酶切片断数量(peptide number)的多少、序列覆盖率(sequence coverage)的高低，以及酶自切程度的高低、信噪比的强弱等，都会直接影响搜库的结果和蛋白鉴定的成功率。虽然随着各种先进的质谱仪器的出现，蛋白鉴定的成功率已经大大提高，但仪器的进步毕竟还没有到达不需要进行胶内酶解的程度，最终要得到可信度高、重复性好的蛋白鉴定结果，在很大程度上仍然依赖于选用合适的胶内酶解方法(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and VincentR.An optimized protein in-gel digest method for reliable proteomecharacterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)。许多酶解方法都可以用在质谱研究中，也取得了一定的效果，但均存在一定不足(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimized proteinin-gel digest method for reliable proteome characterization byMALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemi stry，2005，34685-89)。加上目前质谱鉴定技术的成本还是非常高，每次实验都去花费大量时间和资金去比较摸索不同酶解方法，对于小规模进行质谱鉴定的实验室来说，代价还是太高。因此，摸索一种简便易行、效果理想的酶解方法就十分必要。较早的胶内酶解方法是Rosenfeld等人在Analytic Biochemistry杂志上报道的(Rosenfeld J，Capdevielle J，Guillemont J C and Ferrara P.In-gel digestionof proteins for internal sequence analysis after one-or two-dimensional gelelectrophoresis.Analytical Biochemistry，1992，203173-179)；随后，又有了几种优化改进后的方法(Hellman U，Wernstedt C，Gonez J and Hel din C H.Improvement of an″In-Gel″Digestion Procedure for the Micropreparation ofInternal Protein Fragments for Amino Acid Sequencing.AnalyticalBiochemistry，1995，224451-455；Rachel R，Tracy I S，Charles M，JosephA L and Philip C A.Mass Spectrometry of Proteins Directly from PolyacrylamideGels.Anal Chem，1996，68(11)1910-1917；Alan D，David C and Liang L.ProteinConcentration and Enzyme Digestion on Microbeads for MALDI-TOF Peptide MassMapping of Proteins from Dilute Solutions.Anal Chem，2000，72(14)3355-3362；Volker E，Konrad B，Christine L，Hans L and Eckhard N.Improvements in Protein Identification by MALDI-TOF-MS Peptide Mapping.AnalChem，2000，72(13)2741-2750；Vukic S and Jasminka G Z.Improvement ofan in-gel tryptic digestion method for matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry peptide mapping byuse of volatile solubilizing agents.Proteomics，2001，11364-1367)。虽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质凝胶内酶解的方法，包括下述步骤：１）将含有目标蛋白的凝胶用超纯水洗涤；将凝胶脱水，干燥；２）将干燥后的凝胶用酸化过的胰蛋白酶工作液浸泡０．５－１．５ｈ后，吸去多余酶工作液；所述酸化过的胰蛋白酶工作液是用８０－１２０ ｍＭ盐酸溶解胰蛋白酶，酸化８－１２分钟，再用ＮＨ↓［４］ＨＣＯ↓［３］将ｐＨ值调节至８．０－９．０得到的溶液；３）加入含有Ｃａ↑［２＋］的缓冲液，３７℃酶解１４－１８ｈ，去除凝胶得到蛋白酶解液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李银心，王旭初，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]