【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学领域，包括免疫耐受性的发展和自身免疫疾病的病理。本专利技术一般地涉及诊断器官特异性的(organ-specific)自身免疫疾病重症肌无力症的改进的方法。
技术介绍
自身免疫疾病(autoimmune diseases)是由于免疫细胞功能或活性异常，造成T细胞不适当的活化，使T细胞攻击自身组织，因而促使产生导致疾病发生与发展的细胞因子(cytokines)和/或自身抗体(autoantibody)(Cotran et al.，Pathologic basis of disease 211-212(6thed.1999)；Scoffed，“Autoantibodies aspredictors ofdisease，”Lancet 3631544-1546(2004))。自身免疫指失去自身耐受性，尽管目前其机制仍不明确(同上所引)。自身免疫疾病可分为全身性的，会影响多个器官或组织；或为局部性的，仅影响单一器官、器官系统或组织(同上所引)。 自身免疫疾病的显著特征是产生对抗自身蛋白质的高亲和性(highaffinity)自身抗体(Robinso...
【技术保护点】
一种诊断受试者中重症肌无力症的方法，包括： （ａ）从受试者采取生物样本；和 （ｂ）检测该生物样本中至少一种自身抗体的量，其中该自身抗体特异性地与选自以下的至少一种蛋白质结合：热休克蛋白６０（序列识别号：１）、热休克蛋白９０α异型体（序列识别号：２）、和热休克蛋白９０β异型体（序列识别号：３）； 其中在该生物样本中存在所述自身抗体表示该受试者患有重症肌无力症。
【技术特征摘要】
US 2005-12-29 11/321,516中具体指明的要素和组合来实现和达到。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述对本发明都只是例示性和解释性的，而不是限制性的，如申明的那样。 附图被并入该说明书并作为其一部分，其图解本发明的几个实施方式，并且，和发明叙述一起，起到说明本发明的原则的作用。 附图简述图1显示按照实施例1的操作规程，以Western印迹法分析用全身性(generalized)MG患者的血清探测过的细胞裂解物，鉴定热休克蛋白60(hsp60)特异性的自身抗体的结果。阳性印迹以“点”标明。样本取自患有胸腺增生的女性患者(HF)，患有胸腺增生的男性患者(HM)，患有胸腺瘤的女性患者(TF)和患有胸腺瘤的男性患者(TM)。 图2显示按照实施例1的操作规程，以Western印迹法分析用全身性MG患者的血清探测过的细胞裂解物，鉴定热休克蛋白90(hsp90)特异性的自身抗体的结果。阳性印迹以“点”(dot)标明。样本取自患有胸腺增生的女性患者(HF)，患有胸腺增生的男性患者(HM)，患有胸腺瘤的女性患者(TF)和患有胸腺瘤的男性患者(TM)。 图3显示按照实施例2的操作规程，用全身性MG症患者的血清进行酶联免疫吸附测定(ELISAs)，鉴定hsp60的结果。以横条表示OD450的平均值。 图4显示按照实施例2的操作规程，用全身性MG症患者的血清进行酶联免疫吸附测定，鉴定hsp90的结果。以横条表示OD450的平均值。这些实验没有区分hsp90的α异型体和β异型体。 图5显示本发明的诊断方法正确地将患有MG的患者归为“试验阳性”(test positive)而把不患有MG的患者归为“试验阴性”(test-negative)的能力。试验阳性的患者具有可特异性结合hsp60(“protein_1”)和/或hsp90(“protein_2”)的自身抗体，试验阴性反应的患者则缺乏hsp60(“protein_1”)和/或hsp90(“protein_2”)特异性的自身抗体。 表1显示缺少AChR自身抗体的阶段I或阶段IIa MG患者显示hsp60或hsp90自身抗体，如ELISAs测定的。 表2比较针对(1)AChR；(2)hsp60；(3)hsp90；(4)hsp60+hsp90；(5)AchR+hsp60；或(6)AchR+hsp90特异性的检测的诊断灵敏度。针对只有AchR特异性的自身抗体的测试对于患有阶段I(眼肌)MG的患者显示最低灵敏度。 序列简述序列识别号1为人类热休克蛋白60(hsp60)的氨基酸序列。 序列识别号2为人类热休克蛋白90α异型体(hsp90α)的氨基酸序列。 序列识别号3为人类热休克蛋白90β异型体(hsp90β)的氨基酸序列。具体实施方式I诊断自身免疫疾病(autoimmune disorder)的方法本发明的一方面提供了诊断受试者中重度肌无力症的方法，包括采集来自受试者的生物样本；和检测该生物样本中至少一种自身抗体的量，其中该自身抗体特异性地与选自下列的至少一种蛋白质结合热休克蛋白60(hsp60(序列识别号1))、热休克蛋白90α异型体(hsp90α(序列识别号2))、和热休克蛋白90β异型体(hsp90β(序列识别号3))。 自身免疫性疾病是以免疫功能异常为特征，且经常以自身抗体的存在为特征的疾病或障碍。自身抗体为任何一种同型(isotype)的免疫球蛋白(Ig，或称为“抗体”)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM等，其可特异性地与目标抗原结合，所述目标抗原来自产生该Ig蛋白或抗体的相同生物所产生的蛋白。以自身抗体为特征的自身免疫疾病，包括如艾迪生病(Addison’s disease)(抗21-羟化酶的自身抗体)；乳糜泻(coeliac disease)(抗组织转谷氨酰胺酶(transglutaminase)的自身抗体)；I型胰岛素依赖型糖尿病(抗GAD-65和/或胰岛素的自身抗体)；格雷氏(Graves’)病/甲状腺亢进(抗促甲状腺素激素受体(thyroid-stimulating-hormone receptor)的自身抗体)；桥本氏(Hashimoto’s)甲状腺炎(抗甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase)和/或甲状腺球蛋白(thyroglobulin)的自身抗体)；重症肌无力症(抗烟碱性乙酰胆碱受体和/或肌肉特异性受体酪氨酸激酶的自身抗体)；古德帕斯丘(Goodpasture’s)综合征(抗肾小球基底膜的第IV型胶原蛋白的自身抗体)；天疱疮(抗桥粒芯蛋白(desmogleins)3的自身抗体)；恶性贫血(抗H/K ATP酶的自身抗体)；原发型胆汁性肝硬化(抗E2PDS的自身抗体)；白癜风(抗酪氨酸酶和/或SOX-10的自身抗体)；多发性硬化症(自身抗体攻击髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein)和/或髓鞘寡树状糖蛋白(myelin oligodendriticglycoprotein)；系统性红斑狼疮(抗剪接体snRNA(spliceosomal snRNA)，Ro/La核糖核颗粒(Ro/La ribonuclear particle)，组蛋白(histone)和/或天然DNA的自身抗体)；干燥(sjgren’s)综合征(抗Ro/La核糖核颗粒(Ro/La ribonuclearparticle)和/或毒蕈碱样受体(muscarinic receptor)的自身抗体)；类风湿性关节炎(抗环瓜胺酸肽(citrillunated cyclic peptide)和/或IgM的自身抗体)等(Scofield，如上所述，在1545页)。 本发明中所使用的“受试者”为动物，包括人类或非人类的哺乳动物，如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、或非人的灵长类，特别是实验哺乳动物、牲畜和家养(domestic)哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳类动物可以是人，在其他实施方式中，所述哺乳类动物可以是啮齿类动物，如小鼠或大鼠。 生物样本为从受试者的细胞、组织或器官采集的任何生物材料。上述生物样本的来源根据待诊断的受试者所表现的具体症状可以不同。生物样本在取得后，可立刻接受分析或被贮存。生物样本若被贮存，则必须用适当的贮存缓冲液将其平衡，并保持在4℃、-20℃、-70℃或深冷(cyrogenic)的液体(如液态氮或液态氦)中。在一个实施方式中，生物样本可由血液、血清或血浆组成。在另一个实施方式中，生物样本可由羊水或乳汁组成。在另一个实施方式中，生物样本可由活组织检查或组织样本、组织或细胞悬液组成。在另一个实施方式中，生物样本也由唾液、脑脊液、淋巴粘液、汗、滑液、泪液或其它临床取样和样本组成。 本发明中关于“特异性结合”或类似描述的意思为二个分子形成在生理条件下维持相对稳定的复合体(complex)(如稳定的抗原/抗体复合物)。该术语也可应用于这样的情况例如，抗原结合区(antigen-binding domain)特异性地针对特定的抗原表位(epitope)，而该表位存在于多个分子中。这样，如果抗体与表位结合，该表位在多种蛋白中的每一个中都存在，则该抗体可以与所述多种蛋白特异性地结合。特异性结合的特征为选择性的相互作用，通常包括高亲和性结合和低到中度的容量(capacity)。非特异性结合通常为选择性较低的相互作用，可能具有低的亲和性和中到高度的容量。一般来说，当亲和度(affinity)至少为105M-1、106M-1、107M-1或108M-1时，认为是特异性结合。如有需要，可改变结合条件来减少非特异性结合而并不显著地影响特异性结合，这样的条件在本领域是公知的，且使用常规技术的本领域技术人员可以选择合适的条件。上述条件通常是通过确定抗体浓度、溶液中的离子强度、温度、结合时间、无关的分子(如封闭剂，如血清白蛋白、乳酪蛋白)的浓度等来限定的(Morgan et al.，“The Matrix Effects on Kinetic RateConstants of Antibody-Antigen interactions Reflects Solvent Viscosity，”J.Immunol.Meth.21751-60(1998)；和Zhuang et al.，“Measurement of AssociationRate Constant of Antibody-Antigen Interaction in Solution Based onEnzyme-Linked Immunosorbent Assay.“J.Biosci.Bioeng.92(4)330-336(2001))。 A.自身抗体的测量根据本发明的方法确定抗体的量，包括定性和定量的检测方法。定性方法仅测量生物样本中是否存在特定的自身抗体。定量方法除了确定生物样本中是否存在特定的自身抗体，也可确定其以多大的量存在。上述定性及定量方法都是公知技术。例如，Western印迹法、免疫印迹法(immunoblotting)、免疫荧光法(immunofluorescence)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)及其它类似技术。 1.Western印迹法Western印迹法首先为电泳步骤，该步骤利用聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)，根据蛋白质的大小及所带电荷，将目的蛋白质分离，然后将所述蛋白质转移到带电荷的膜上。完成转移后开始进行杂交步骤，先以封闭(blocking)步骤将膜上未反应的结合位置封闭，以抑制抗体的非特异性吸附，之后加入第一抗体并孵育以与一或多个目标抗原结合，最后加入第二抗体并孵育，其中利用放射显影(radiographic)、产色(chromogenic)或化学发光(chemiluminescent)材料测量在第一抗体孵育中所形成的抗原-抗体复合物。第二抗体通常可特异性地识别所有同型免疫球蛋白共有的恒定区(Fc)。第二抗体可来自于多种哺乳类动物，包括但不限于兔子、绵羊、山羊、小鼠及大鼠。 为了通过Western印迹法测量可特异性地识别MG特征性自身抗原的自身抗体的量，将纯化或重组的一或多种MG特征性自身抗原的制备物，先用公知技术进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(参照Sambrook et al.，Molecular cloningA laboratory manualA8.40-A8.45(2001))(介绍许多用SDS-PAGE进行蛋白质电泳的试剂及方法)。之后，将凝胶中的内容物转移到硝化纤维素(nitrocellulose)、尼龙(nylon)、聚偏二氟乙烯(PVDF)，或其他适用于固定及Western印迹法的其它膜或滤纸，上述固定及Western印迹法的标准技术在本技术领域是同样公知的。上述转移方法可为湿式(immersion)或半干式(semi-dry)转移法，也可为其它类似的公知技术。 或者，纯化或重组的一或多种自身抗原的制备物可以直接点样(spot)到硝化纤维素、尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)等其它的膜或其它适用于固定及Western印迹法的膜或滤纸上。若无法得到纯化或重组的目标自身抗原制备物，也可以公知标准技术从细胞裂解物或组织匀浆获得自身抗原。 接着所述膜或滤纸被固定，以避免在后续Western印迹法的多次杂交、洗涤、和染色步骤中流失目标蛋白。固定可通过加热、紫外线交联(cross-linking with ultraviolet light)或其它公知的方法来实现(参照Sambrooket al.，3 Molecular cloningA laboratory manual A8.52-A8.55(介绍许多免疫印迹及检测抗原/抗体复合物的方法))。 用缓冲溶液(如磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffer saline，PBS)等其它类似溶液)来封闭经固定的膜或滤纸上的非特异性抗体结合位点，上述缓冲溶液中含有封闭剂，如0.5％(w/v)的低脂奶粉(dry milk)或5％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)等。封闭后，对膜或滤纸进行第一抗体孵育，其中该膜或滤纸与取自待诊断自身免疫疾病的受试者的生物样本共同孵育。 在与第一抗体孵育(incubation)完成后，洗涤上述膜或滤纸，并用第二抗体检测自身抗体/自身抗原复合物，上述第二抗体上标记有能显色(chromogenic)、发荧光(fluorogenic)或化学发光(chemiluminescent)的材料。上述的自身抗体/自身抗原复合物可以用比色法(如辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)和TMB)或放射自显影法(如碱性磷酸酶)测量。若利用比色法或化学发光法，则此颜色或荧光的量可用发光计(luminometer)、分光光度计(spectrophotometer)或其它类似仪器来测量。若为放射自显影法，则结合抗体量可以光密度计或其它类似仪器测量曝光的X光片得知(参照Sambrook et al.，Molecular CloningA laboratory manual A8.52-A8.55(介绍许多免疫印迹及测量抗原/抗体复合物的方法))。 用于定性或定量分析的第二抗体，不管是单克隆还是多克隆抗体，都可用配体(如生物素)或可测量的标记(如荧光或酶)以常规技术标记。较适合的标记包括荧光团(fluorophores)、生色团(chromophores)、电子致密试剂(electron-dense reagents)(如金或银)、酶，和具有特定的结合伙伴(bindingpartners)的配体。酶，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，通常利用其活性来检测。例如，辣根过氧化物酶可利用其使四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色的能力来检测，该反应可用分光分度计定量。其它较适合的配体和/或可测量的标记包括生物素、亲和素(avidin)、或链霉亲和素(streptavidin)、IgG、蛋白质A及其他众多已知的受体-配体对。以公知技术进行的其它置换及可能性对本领域的一般技术人员都是显而易见的，而且都被认为是本发明范围内的等价形式。 在本发明的一个实施方式中，以Western印迹法测量至少一种可特异性地与自身抗原结合的自身抗体的量，上述自身抗原选自热休克蛋白60(hsp60)、热休克蛋白90α异型体(hsp90α)、和热休克蛋白90β异型体(hsp90β)。 标准的Western印迹操作规程有很多通常的变化形式，如Far Western印迹法，定量印迹法，及其他许多方法。本领域的一般技术人员可根据需检测的自身抗体、所使用的自身抗原、检测中所用自身抗原和/或第一自身抗体的来源、及任何其它实验相关参数，选择适合的操作规程。以公知技术进行的其它置换及可能性对本领域的一般技术人员都是显而易见的，而且都是被认为本发明范围内的等价形式。 2.酶联免疫吸附测定法(ELISA)某些酶联免疫吸附测定法是定性的，其仅检测是否存在特定的抗原或抗体；但其他的酶联免疫吸附测定法是定量的，能精确地测量抗原或抗体的浓度。因为酶联免疫吸附测定法易于操作和自动化，所以酶联免疫吸附测定法一般常用于从大量的抗原或抗体中筛选特定的结合特异性。 酶联免疫吸附测定法一开始为抗原吸附(adsorption)步骤，其中一种或多种目标抗原吸附于微量滴定板(microtiter plate)的孔中(参照Kirkegaard &Perry laboratories，Inc.，Technical Guide for ELISA 9-13(2003)，可见于http//www.kpl.com/home.cfm#(最近登录是在2005年11月3日)(介绍ELISA的各种微量滴定板和多种将蛋白质吸附到孔中的方法及试剂)。最常用的吸附缓冲液包括50mM碳酸盐，pH＝9.6；10mM Tris-HCl，pH＝8.5；和10mMPBS，pH＝7.2。上述缓冲液适合用于多种蛋白质。若上述一种或多种抗原无法轻易地吸附于微量滴定板的表面，也可使用一般商品化的微量滴定板，其表面经过修饰或衍生化(derivatize)，从而可利用各种化学方法使蛋白质以共价键方式结合于其表面上。时间及温度是影响蛋白质吸附量的最重要的影响因素。 将目标抗原包被在微量滴定板上后，以封闭缓冲液洗涤微量滴定板来去除非特异性结合并最大程度地降低假阳性结果的发生(如上所引，13-14页)(介绍封闭的方法及试剂)。一般常用的封闭试剂或者是蛋白质溶液，如BSA(常用浓度为约1％至5％(w/v)，溶于pH＝7.0的PBS)、脱脂奶粉、酪蛋白(脱脂奶粉的主要蛋白质组分)或酪蛋白酸盐(caseinate)(酪蛋白的一种更易溶的形式，由氢氧化钠部分消化而产生)、一般的血清(常用浓度为约1％至5％(v/v))及明胶(常用浓度约1％至5％(w/v))，或者是非离子型去污剂，如Tween-20TM及Triton X-100TM。 从常规的洗涤剂中选择具有这样能力的洗涤剂，其可以破坏多个反应组分之间的低亲和性相互作用，所述相互作用可能影响特定的抗原-抗体相互作用的检测(参见，例如同上所引14-15页(介绍洗涤微量滴定板的各种方法及试剂))。洗涤溶液通常含有生理缓冲液(physiological buffer)以避免抗原及同源抗体(cognate antibodies)变性，并维持酶的活性。常使用与中性pH的缓冲液，如PBS、Tris-盐水、咪唑缓冲盐水(imidazole-buffered saline)等。通常根据特定测量试验所用的检测方法选择特定缓冲液。同时，洗涤缓冲液也应含有浓度在0.01％至0.05％(v/v)的非离子型去污剂如Tween-20TM和TritonX-100TM等，以破坏反应成分间低亲和性、非特异性的相互作用。 在封闭步骤后，洗涤微量滴定板的孔，然后对吸附的抗原进行第一抗体孵育，其中该抗原与生物样本共同孵育，所述生物样本取自待诊断自身免疫疾病的受试者。在第一抗体孵育完成后，洗涤孔并加入已标记显色物质(如辣根过氧化物酶及TMB)、发荧光物质或化学发光物质(如碱性磷酸酶)的第二抗体来检测自身抗原-自身抗体的复合物(同上所引15-21页(介绍抗体的制备及使用，和一般常用的检测分子))。最后利用发光计、分光光度计等其它类似仪器来测量颜色与荧光的量。 标准酶免疫分析操作规程有种种改变，如竞争性ELISA法、夹心ELISA法等。本领域的一般技术人员可根据要测量的抗体、所使用的抗原、抗原和/或第一抗体的来源、和实验上相关的参数选用适合的操作规程。以公知技术进行的其它置换及可能性对于本领域的一般技术人员都是显而易见的，而且都被认为是本发明范围内的等价形式。 B.重症肌无力症的临床类型Osserman和Genkins等人将成人的重症肌无力症患者分为4大类(Osserman，K.E.和Genkins，G.，“Studies in myasthenia grayisreview of atwenty-year experience in over 1200 patients，”Mt.Sinai J.Med.38(6)497-537(1971)；“Myasthenia Gravis，”可见于http//www.neuroland.com/nm/myas_gra.htm(最近登录是在2005年12月1日))。接近20％的患者被诊断为第I型，30％为第IIA型，20％为第IIB型，11％为第III型，9％为第IV型。其余的10％的患者一般为源自儿童型(Osserman and Genkins，如上所述在502页)。 第I型MG又称为眼肌型重症肌无力症，症状一般局限于单眼或双眼的肌肉。其特征为上睑(ptosis)下垂及复视，但若2年内上述症状不发展至其它肌肉，则此型重症肌无力症通常不会发展。此型的重症肌无力症患者只有55％具有可特异性地识别AChR的自身抗体(Osserman，K.E.and Genkins，G.，如上所述在501；“Myasthenia Gravis，”可见于http//www.neuroland.com/nm/myas_gra.htm(最近登录是在2005年12月1日))。 第IIa型MG又称为轻度全身性重症肌无力症，其症状倾向于发展缓慢，有时开始于眼球外肌但逐渐地发展至骨骼肌和延髓肌。但呼吸系统的肌肉通常不会被影响到。此型患者约有80％具有可特异性地识别AChR的自身抗体。第IIb型MG又称为中度全身性重症肌无力症，其症状发展缓慢，一般开始于眼球外肌且逐渐地发展至骨骼肌和延髓肌。此型的症状通常较第IIa型MG严重，呼吸系统的肌肉仍然不受影响(spared)(Osserman，K.E.and Genkins，G.，如上所述at 501-02；“Myasthenia Gravis，”可见于http//www.neuroland.com/nm/myas_gra.htm(最近登录是在2005年12月1日))。 第III型MG又为称急性暴发型重症肌无力症，此型相当严重或急性，症状在骨骼肌和延髓肌中快速地出现，且较早地影响到呼吸系统的肌肉。第III型的重症肌无力症患者一般会发生胸腺瘤。疾病的进展通常在6个月内完成。第III型MG患者死亡率高。此型的患者几乎100％都具有可特异性地识别AChR的自身抗体(Osserman，K.E.G.，如上所述在502；“MyastheniaGravis”可见于http//neuroland.com/nm/myas_gra.htm(最近登录是在2005年12月1日))。 第IV型MG又称为晚发性严重型重症肌无力症，此型为慢性、严重的病症，一般在第I和类似II型症状发生后2年以上才发展至此型MG。此型的重症肌无力症患者约有89％具有可特异性地识别AChR的自身抗体(Osserman，K.E.and Genkins，G.，如上所述在502；“Myasthenia Gravis，”可见于http//neuroland.com/nm/myas_gra.htm(最近登录是在2005年12月1日))。 于重症肌无力症的患者身上常常(regularly)观察到至少2种的胸腺病变会发生。约50％的MG患者患有不同程度的胸腺增生。约15％的患者最终发生胸腺瘤。在一些病例中，重症肌无力症患者可以进行胸腺切除来成功治疗，胸腺切除的结果是50％以上的重症肌无力症患者的症状可得到持续的改善，虽然在年老患者中的效果要差一些(Osserman，K.E.and Genkins，G.，如上所述在515-23)。 C.与重症肌无力症有关的自身抗体目前已有多种可鉴别与特定的自身免疫疾病相关的候选自身抗原的方法，包括，例如记载在2005年6月9日公开的美国专利公开号US-2005/0124076-A1号中的方法，该公开专利并入本申请作为参考。依照上述方法，从健康个体和患自身免疫疾病(如重症肌无力症)的个体的血清样本中纯化血清抗体。将纯化的免疫球蛋白以共价键的方式结合层析介质，制备亲和层析柱。然后分析从患有MG的受试者中纯化的蛋白质样品，例如来自参与该疾病的病因学和进展的器官、组织或细胞类型的蛋白质样品。 例如，为了鉴定与MG相关的候选自身抗原，可以使用来自成熟神经肌肉接头的肌肉终板的蛋白质样本，所述肌肉终板处发生了MG特征性的免疫介导(immune-mediated)的乙酰胆碱受体损失。先将上述蛋白质样本通过含有分离自健康个体的免疫球蛋白的层析柱，然后将不结合的蛋白质通过含有从MG患者分离的免疫球蛋白的层析柱，所有结合于第二个层析柱的蛋白质都是候选的自身抗原，洗脱后可用于后续的分析，如质谱(mass spectrometry)，以鉴定各种分离的蛋白质。 由上述方法，hsp60和hsp90被鉴定为两种新的重症肌无力症患者的候选自身抗原。由ELISA分析的结果发现，在重症肌无力症的早期(第I和IIa期)患者中，并无特异性结合AChR的自身抗体，但却有特异性结合hsp60及hsp90的自身抗体。通过检测这些自身抗体可提供针对重症肌无力症的新型诊断方法，尤其是在缺少MG最常见的相关自身抗体——AchR自身抗体的早期MG患者中诊断MG的方法(参照例如图5)。。 此外，也可用其它方法来鉴定重症肌无力症的候选自身抗原，如筛选cDNA表达基因库或通过消减噬菌体展示。为了通过这些方法鉴定可能的自身抗原，利用分离自与MG病因及疾病发展相关的器官、组织或细胞种类(如成熟神经肌肉接头的肌肉终板)的mRNA来构建噬菌体展示系统或其它的蛋白质表达数据库。用免疫球蛋白筛选这些文库，其中所述免疫球蛋白是从待了解的自身免疫疾病个体的血清样本中纯化的，并将结果与使用从健康者血清中纯化的免疫球蛋白所得结果作比较。 除了上面列出的以外，标准的自身抗原筛选步骤还有很多的变化形式。本领域的一般技术人员可根据要研究的自身免疫性疾病、所使用的自身抗原、筛选候选自身抗体的生物样本的来源、及任何其它实验相关参数，选择适合的操作规程。以公知技术进行的其它置换及可能性对本领域的一般技术人员都是显而易见的，而且都是被认为本发明范围内的等价形式。 1.热休克蛋白(Heat-Shock Proteins)在环境温度突然升高或出现其它恶劣条件时，生物体会因此应激合成一小组进化上保守的蛋白质，称为热休克蛋白。在演变过程中，热休克反应的性质及各种热休克蛋白家族成员的氨基酸序列都高度保守。例如，真核生物与原核生物的热休克蛋白70(hsp70)在氨基酸水平上具有约50％的同一性(Parsell et al.，“The function of heat-shock proteins in stress tolerancedegradation and reactivation of damaged protein，”Ann.Rev.Genet.27437-496(1993))。热休克蛋白家族各种不同成员的在保护生物体免于环境应激中起不同作用。 a.热休克蛋白60(60kD Heat-Shock Protein)热休克蛋白60(hsp60)主要存在于粒线体基质，其占线粒体基质所有蛋白质的1％(Parsell et al.，如上所述在465页)。人类hsp 60(氨基酸序列1)与其大肠杆菌同源物GroEL在氨基酸序列上具有约60％同一性(同上所引)。上述二种蛋白质有相同的寡聚体结构(oligomeric structure)，其由单个7元环(seven-membered ring)构成，有时则可形成双7元环(two seven-membered rings)的双环(double doughnut)结构(同上所引)。hsp60具有随温度升高而增加的ATP酶活性；ATP的结合导致所述寡聚体结构发生显著的构象改变(同上所引)。 hsp60不同于其它的热休克蛋白，它在正常的温度下行使功能(同上所引，第465-66页)，其在所有的温度下对生长都是必需的(同上所引)。hsp60以高度的亲和性结合去折叠(unfolded)或变性的蛋白质，并促使它们进行适当的折叠。变性蛋白质在与hsp60结合时开始具有二级结构的元件，尽管更复杂的结构元件的形成被阻止。 b.热休克蛋白90(90kD Heat-Shock Proetin)热休克蛋白90(hsp90)在迄今为止被研究的所有真核生物的细胞质及细胞核中都有发现，但仍未发现存在于细胞器的hsp90类物质(Parsell et al.，同上在470)。hsp90在细胞质中具有两种异型体(isoform)结构，分别为受诱导表达的、占多数的类型hsp90α(序列识别号2)和组成性表达的、占少数的类型hsp90β(序列识别号3)(Sreedhar et al.，“hsp90 isoformfunctions，expression and clinical importance，”FEBS Letters 56211-15(2004))。α和β异型体难于通过生化的方式来分离，因此目前都是使用二者的混合物来进行hsp90的生物功能的相关研究。 人类的hsp90α与其大肠杆菌中的同源物HtpG在氨基酸序列上具有约40％同一性(Parsell，如上所述)。HtpG在正常温度时可维持相当的丰度，在高温时可被大量诱导产生，但它并不是必需的在将其基因删除后，并不会影响大肠杆菌在正常温度的生长，只稍微影响它在高温的生长(同上所引)。相反，hsp90是真核细胞中丰度最高的蛋白质之一，在非应激条件下，它占总细胞蛋白质的1-2％。若将真核生物的hsp90基因删除，会导致生物体的死亡，表示真核生物的hsp90具有在原核生物没有的、关键性的新功能(Sreedhar et al.，如上所述；Parsell et al.，如上所述)。 hsp90可与细胞中许多其他蛋白质反应，包括酪蛋白激酶II(caseinkinaseII)、血红素调节的eIF-2α激酶(heme-regulated eIF-2αkinase)多种类固醇激素受体如雌激素(estrogen)、黄体酮(progesterone)、雄激素(androgen)、糖皮质类固醇(glucocorticoid)和二英(dioxin)的受体，src家族的致癌酪氨酸激酶(oncogenic tyrosine kinases of the src family)、钙调理素(calmodulin)、肌动蛋白(actin)和微管蛋白(tubulin)等(Parsell et al.，如上所述在471)。经实验发现，在细胞的分化及发育中，hsp90具有多种功能，如调控肌肉发育、早期胚胎发育和程序性细胞死亡(programmed cell death)或细胞凋亡(apoptosis)(Sreedhar et al.，如上所述在12)。此外，一些证据提示hsp90与例如胰脏癌、乳腺肿瘤等多种肿瘤，及白血病(同上所引，第13页)相关。另外，在全身性红斑狼疮患者中伴随有hsp90β的转录升高；红斑狼疮为自身免疫疾病，其特征为抗自身的剪接体snRNA，Ro/La核糖核颗粒(Ro/La ribonuclearparticle)，组蛋白(histone)和/或天然DNA等的自身抗体(同上所引)。 II、诊断自身免疫疾病的试剂盒本发明的检测方法可由检测试剂盒来进行，上述检测试剂盒包含一或多种上述检测自身抗体的技术，所述自身抗体特异性地与至少一种重症肌无力症的特征性自身抗原结合。例如，在一个实施方式中，上述试剂盒以Western印迹法分析上述自身抗体的量。在一个方面中，上述试剂盒包含多个试纸条(test strips)，其上固定了等份的本发明的两种新自身抗原hsp60和hsp90α/hsp90β的每一种。 在一个实施方案中，上述检测试剂盒还包含对每个自身抗原特异的对照抗体(control antibodies)；第二抗体，其以直接或间接的方式与辣根过氧化物酶或任何有助于使自身抗原-自身抗体复合物可见的试剂偶联；以及在Western印迹法的封闭、洗涤、杂交和检测等步骤中所有需要的试管、容器或反应器、缓冲液和试剂。上述对照抗体蛋白可以以溶于合适的缓冲液或溶剂，或冷冻干燥粉末等形式来提供。类似地，所述缓冲液和其他试剂可以以预混合的形式提供，或者以干燥形式提供，若为干燥的形式，使用者必须将其复溶(reconstitute)。此外，该检测试剂盒还包含其它成分、包装、说明书或其他可帮助检测自身抗体的材料。 在另一个实施方式中，上述试剂盒可以用ELISA来测量自身抗体的量。在一个方面，上述试剂盒包含多个微量滴定板，所述微量滴定板用本发明的二种新自身抗原hsp60和hsp90α/hsp90β中的每一种包被。 在一个实施方式中，上述试剂盒还包括对各自身抗原特异性的对照抗体，第二抗体，其以直接或间接的方式与辣根过氧化物酶或任何有助于使自身抗原-自身抗体复合物可见的试剂偶联；以及在ELISA的封闭、洗涤、杂交和检测等步骤中所有需要的试管、容器或反应器、缓冲液和试剂。上述对照抗体蛋白可以以溶于合适的缓冲液或溶剂，或冷冻干燥粉末等形式来提供。类似地，所述缓冲液和其他试剂可以以预混合的形式提供，或者以干燥形式提供，若为干燥的形式，使用者必须将其复溶。此外，该检测试剂盒还包含其它成分、包装、说明书或可帮助检测自身抗体的材料。 实施例实施例1以Western印迹法鉴定自身抗体血清样本取自中华民国台湾新光医院209位重症肌无力症患者。可将这些患者依其胸腺的病理分为四大类其中37位患者有不同程度的胸腺萎缩(thymic atrophy)；121位的患者出现胸腺瘤(thymoma)；40位患者有一定程度的胸腺增生(thymic hyperplasia)；且11位患者有未知的胸腺病理。此外，76位患者为笫I型MG，81位为第IIa型MG，38位为第IIb型MG，14位为第III或第IV型MG。阴性对照组(negative control)的血清样本为来自台中荣民总医院的54位患者，他们患有另一种不相关的、非源于自身免疫的疾病膜状肾小球肾炎(Membranous glomerulonephritis，MGN)。 将HepG2/C3A细胞的细胞裂解物通过10％的SDS-PAGE凝胶分离，上样为每条泳道20μg的细胞提取物和每条泳道2μg的hsp60或hsp90蛋白。电泳过程中，样本在积层(stalking)凝胶时给予80V的电压，而进行至分离凝胶时给予120V的电压。被分级的(fractionated)蛋白质可利用TE70系列半干式转移单位转移器(TE70 Series Semi-dry Transfer Unit)(AmershamBioscience)根据制造商的指示转移到PVDF上。所使用的转移缓冲液为Towbin Buffer(1倍的浓度为25mM Tris-HCl，pH＝8.30，192mM甘氨酸和20％(v/v)甲醇)。 上述PVDF膜在含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液(80mM Na2HPO4，20mMNaH2PO4，100mM NaCl，0.05％-0.1％(v/v)Tween-20)中于室温反应1小时或置于4℃过夜来进行封闭。将患者血清以1∶1000的比例稀释于含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液中，并在室温下与经封闭的PVDF膜共孵育1小时。与第一抗体孵育后，以PBST缓冲液洗涤上述PVDF膜。然后该膜在室温与第二抗体共孵育1小时，上述第二抗体为与辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG(anti-human IgG)，它以1∶5000稀释于含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液中。上述第二抗体为辣根过氧化物酶偶联的Fcγ特异性的鼠抗人IgG(horseradishperoxidase-conjugated mouse anti-human IgG)(Jackson immunoResearchLaboratories，Inc.)，它购自Biosource International，of Camarillo，CA.USA。与固定化抗原结合的自身抗体通过酶联化学发光检测，使用ECL印迹底物(Amersham Pharmacia Biotech)根据制造商的指示进行。 图1和2显示了上述实验的结果，样本取自患有胸腺增生的女性患者(HF)，患有胸腺增生的男性患者(HM)，患有胸腺瘤的女性患者(TF)和患有胸腺瘤的男性患者(TM)。hsp60或hsp90特异性抗体阳性的样本以“点”标明，即具有可识别热休克蛋白60、热休克蛋白90的自身抗体。这些实验显示许多处于MG较晚阶段的患者具有hsp60和hsp90特异性的自身抗体。 实施例2以酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量自身抗体以酶联免疫吸附测定法对实施例1的血清样本等份进行进一步分析。ELISA微孔板(Coming Life Sciences，New York，NY，USA)用溶于0.1MNaHCO3pH＝8.6中的0.2μg的人hsp60(纯化自大肠杆菌)或hsp90(纯化自酿酒酵母(S.cerevisiae))在4℃下包被过夜。上述两种重组热休克蛋白购自Sigama-Aldrich Co。将已包被的微孔板用PBS洗涤3次，每次1分钟，然后在37℃与200μl的封闭溶液(5mg/ml的BSA的PBST溶液)共孵育1小时，每个孔用PBST洗涤6次，每次1分钟。之后将该板与以1∶100到1∶800稀释在封闭溶液中的患者血清在37℃反应1小时30分钟。与第一抗体孵育后，再用封闭溶液将微孔板洗涤6次，每次1分钟，然后与第二抗体在室温下共孵育1小时，上述第二抗体为辣根过氧化物酶偶联的Fcγ特异性的小鼠抗人IgG(Jackson immunoResearch Laboratories，Inc.)，它以1∶10,000稀释于含5mg/ml BSA的PBST缓冲液中。然后将微孔板在室温用含5mg/ml BSA的PBST缓冲液洗涤6次，并加入100μl的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine)(TMB)溶液显色。上述TMB溶液以50mM的柠檬酸磷酸盐(citrate phosphate)制备。在加入TMB溶液后，于室温孵育30分钟，依照仪器的操作手册以MRX Microplate Reader(Dynex Technologies)测量波长450nm时的吸光度。 这些实验的结果如图3(hsp60)和图4(hsp90)显示，其比较对照组与MG患者组的ELISA分析结果，该MG患者组包括处于该病所有阶段的患者。波长450nm的吸光度平均值以水平线表示。这些实验并未区分hsp90α和hsp90β异型体。上述结果表示所有阶段的重症肌无力症患者都具有hsp60和hsp90特异性的自身抗体。 表1显示，通过检测可特异性结合hsp60及hsp90的自身抗体的存在，MG在缺乏AChR自身抗体的第I和IIa型MG患者中可以得到准确的诊断。用ELISA对40位患者进行hsp60和hsp90特异性的自身抗体的检测，患者中24位被诊断为第I型MG，16位诊断为第IIa型MG。检测按照实施例2所述的操作规范进行。吸收值的读数按照标准方法转换成蛋白质浓度。分界点(cutoff points)为(1)OD450＝0.2(AChR)；(2)OD450＝0.375(hsp60)；(3)OD450＝0.232(hsp90)。所有40位患者都没有可检测到的AChR自身抗体(表中标为“AChR”的列)，而其中28位患者具有可测量水平的hsp60自身抗体(24位第I型患者中有18位，16位第IIa型患者中有10位)。33位患者具有可测量水平的hsp90自身抗体(24位第I型患者中有21位，16位第IIa型患者中有12位，标为“hsp90”的列)。 表1表1显示以ELISA分析重症肌无力症患者，发现在第I或IIa时期并无可识别AChR的自身抗体，但具有可识别hsp60或hsp90的自身抗体。 图5显示本发明有助于重症肌无力症的“灵敏(sensitivity)”与“特异性(specific)”的诊断。“灵敏度”(sensitivity)衡量的是诊断为MG的患者中，。对特异性结合hsp60(“protein_1”)或hsp90(“protein_2”)的自身抗体检测为阳性的比例(Hennekens et al.，Epidemiology in medicine 331-335(1st ed.1987))。“特异性”衡量的是非MG患者中，对特异性结合hsp60(“protein_1”)或hsp90(“protein_2”)的自身抗体检测为阴性的比例(同上所引)。该实验证明，在缺乏可与AChR特异性结合的自身抗体的眼肌型肌无力症(第I型)及轻度、全身性(第IIa型)MG患者中，有76％的患者具有与hsp60特异性结合的自身抗体，且86％的患者具有与hsp90特异性结合的自身抗体；此外，在非重症肌无力症患者中，有91％的患者的hsp60自身抗体检测为阴性，有86％的患者的hsp90自身抗体检测为阴性。 表2显示，相比于只检测对AChR特异性的自身抗体，检测特异性地结合hsp60、hsp90、hsp60+hsp90、AChR+hsp60、或AChR+hsp90等的自身抗体能够更灵敏地鉴定阶段1(眼肌型)MG。表2总结的数据得自73位阶段I的MG患者的样本，使用如表1所讨论的ELISA分析和分界(cutofff)值。 表2表2显示分别比较(1)AChR；(2)hsp60；(3)hsp60+hsp90；(4)hsp60+hsp90；(5)AChR+hsp60；(6)AChR+hsp90的不同鉴定方法的灵敏度。结果显示可识别AChR的自身抗体仅出现在第I期的眼肌型肌无力症患者，且灵敏度最低。 本发明通过hsp60和/或hsp90提供了一种新型、灵敏、特异性的诊断重症肌无力症，尤其是在该病的早期阶段的患者中诊断重症肌无力症的方法，上述早期阶段的患者缺少该疾病最常用的相关临床标记(clinical marker)——抗AChR的自身抗体。 本说明书当根据本说明书中所引文献的教导充分地理解。本说明书中的实施方式部分提供对本发明的实施方式的说明，不应被理解为对本发明范围的限制。本领域的技术人员很容易认识到，其他实施方式也为本发明所包括。本公开中引用的所有出版物和专利都被以全文引入作为参考。至于当任何通用词典、技术词典或被引入作为参考的材料与该说明书冲突或者不一致时，本说明书当优先于任何这样的材料。本文中对任何参考文献的引用并非承认该文献为本发明的现有技术。 除非另有说明，所有表示本说明书包括权利要求中所用的成分的量、反应条件等等的数字，应被理解为在一切情况下均被术语“大约”所修饰。因此，除非另有相反的说明，数字表示的参数都是近似值，而且可能根据本发明寻求获得的所希望的性质而变化。在最低限度上，并且不作为将等同原则的适用限制于权利要求的范围的企图，每个数字表示的参数应该根据有效位数和普通的舍入方法来理解。 除非另有说明，位于一系列元素前面的术语“至少”应当理解为指的是该系列中的每一个元素。本领域的技术人员仅利用常规实验就将认识到或者能够发现本文中描述的该发明的具体实施方式的等价方案。这些等价方案当为下面的权利要求所涵盖。 参考文献[001]COTRAN ET AL.，PATHOLOGICBASIS OFDISEASE211-212，1289(W.B.Saunders Co.，Philadelphia，...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾锱翎，郑平福，廖秀，邱浩彰，蔡世峰，
申请(专利权)人：财团法人工业技术研究院，财团法人卫生研究院，财团法人新光吴火狮纪念医院，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]
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