气相色谱法测定人血清棕榈酸和油酸浓度比的方法技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种气相色谱法测定人血清棕榈酸和油酸浓度比的方法及在肥胖人群冠状动脉粥样硬化性心脏病（ＣＡＤ）快速诊断中的应用，包括将人血清样品衍生化处理后，用气相色谱仪测定其中（游离的）棕榈酸（ＰＡ）和油酸（ＯＡ）浓度的比例，并根据比例诊断冠状动脉粥样硬化性心脏病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种气相色谱法测定人血清棕榈酸(PA)和油酸(OA)浓度比的方法及在肥胖人群冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)诊断中的应用。
技术介绍
动脉粥样硬化(atherosclerosis)是指动脉发生了非炎症性、退行性和增生性的病变，导致管壁增厚变硬，失去弹性和管腔缩小。动脉粥样硬化的病理变化主要累及体循环系统的大型弹力型动脉(如主动脉)和中型肌弹力型动脉(以冠状动脉和脑动脉罹患最多)，受累动脉的病变从内膜开始，先后有多种病变同时存在，包括局部有脂质和复合糖类积聚，出血和血栓形成，纤维组织增生和钙质沉着，并有动脉中层的逐渐退化和钙化。现代细胞分子生物学技术显示，动脉粥样硬化病变都具有平滑肌细胞增生，大量胶原纤维、弹力纤维和蛋白多糖等结缔组织基质形成，以及细胞内外脂质积聚的特点(Science，1801332-1339，1973)。动脉粥样硬化(AS)是一种系统性疾病，可以累及冠状动脉、脑血管、肾血管、主动脉以及周围血管等。尽管对其的诊断、治疗和预防都取得了重大进展，动脉粥样硬化仍然是工业化国家的首要死亡原因。其中，因冠状动脉粥样硬化使血管腔阻塞导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，既冠状动脉粥样硬化性心脏病，是全世界的主要死亡原因之一，而到2020年动脉粥样硬化性心脏病更将是人类的第一号杀手(Lancet，3491269-1276，1997)。目前的降脂、抗凝、溶栓以及基于导管的各种治疗方法，能够处理某些局部的病变，在一定程度上降低病人的死亡率和致残率，但并不能延缓冠状动脉粥样硬化性心脏病的病理过程(Circulation，1092595-2604，2004)。以往人们的研究主要集中在对动脉粥样硬化所致的心脏损害进行对症治疗，而近年来人们越来越注重把冠状动脉粥样硬化性心脏病当作一种系统性疾病进行研究，探索冠状动脉粥样硬化性心脏病发病的分子生物学机制，寻求阻断其发生发展的有效方法。肥胖是CAD的主要病因之一。肥胖患者的脂肪组织中肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System，RAS)活性上调，可促进血压增高和胰岛素抵抗。此外，肥胖组织分泌的细胞因子如肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、白介素6(Interlukin 6，IL-6)、己二腈，会导致胰岛素抵抗，并且与动脉粥样硬化斑块的形成、发展密切相关(Eur J Clin Invest，32(suppl3)24-34，2002)。胰岛素抵抗可使脂肪组织游离脂肪酸摄取减少，分解增加。后者在肝脏转化成为富含甘油三脂的极低密度脂蛋白微粒，促进低密度脂蛋白氧化修饰，加速高密度脂蛋白清除，促进动脉粥样硬化(J Clin Invest，106453-458，2000)。此外，低水平的高密度脂蛋白还可能是ATP结合盒转运子1表达降低的结果，后者介导外周细胞胆固醇的逆转运(J Lipid Res，421717-1726，2001)。因此，对于肥胖导致的CAD的诊断，显的尤为重要。CAD发展到相当程度，尤其有器官明显病变时诊断并不困难，但早期诊断很不容易，而有针对性的对易感高危人群如肥胖人群的诊断，更是非常缺乏。现有的CAD诊断方法包括 1.患者常有血胆固醇、甘油三酯增高，高密度脂蛋白减低，脂蛋白电泳图形异常，多数患者表现为第III或第IV型高脂蛋白血症。2.X线检查可见主动脉伸长、扩张和扭曲，有时可见钙质沉着。3.动脉造影可显示四肢动脉、肾动脉与冠状动脉由于粥样硬化所造成的管腔狭窄、病变部位及范围。4.多普勒超声波检查有助于判断四肢动脉、肾动脉血流通畅情况。本专利技术提出了一种快速诊断肥胖人群动脉粥样硬化性心脏病的方法，采用本方法对该病的早期诊断及辅助诊断提供了一条便利快捷的途径。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是气相色谱法测定人血清棕榈酸和油酸浓度比的方法及在肥胖人群冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)快速诊断中的应用。本专利技术的技术方案如下1.标准品用色谱纯的棕榈酸(PA)和油酸(OA)按照1∶1的浓度比配制溶于甲醇中，终浓度为10umol/ml。将标准品和得到的人血清样品衍生化并萃取后得到脂肪酸甲酯化的产物，衍生化和萃取的方法如下2mL血清中加入50％硫酸1mL，甲醇4mL，混匀后50℃-60℃恒温水浴20-30min取出冷却至室温后加蒸馏水4mL，氯仿4mL，振摇3min，3000rpm离心3min，取下层萃取液，并加入无水硫酸钠干燥，1000rpm离心1min，取上层液体，用氮气吹干，溶于50μL氯仿中。2.上步处理后的样品用气相色谱仪先测定标准品，得到棕榈酸和油酸的特征峰位置，然后同样方法检测四组人群(正常人群组，肥胖人群组，不肥胖的CAD患者组，肥胖的CAD患者组)血清自由脂肪酸谱，找到与标准品对应的棕榈酸和油酸的特征峰，根据两者峰面积的比值得到血清样品中棕榈酸和油酸的浓度比例，根据比例来诊断肥胖人群动脉粥样硬化性心脏病的发病可能。气相色谱仪条件如下仪器HP-6890；进样口split-splitless；温度300℃；分流比50∶1；柱HP-INNOWAX，30m×0.25mm×0.25um，流量0.8ml/min；柱温160℃到250℃每分钟升温4℃，保留5分钟，总时间27.5分钟；检测器FID检测器，温度300℃，载气N2；进样1ul。3.每个样例取两次血清，每次血清样品测三次，统计六次结果计算平均值及标准偏差，并将平均值作为此样例血清中棕榈酸和油酸比值的最终值。4.通过上述气相色谱分析四类人群血清棕榈酸和油酸的浓度比例诊断冠状动脉粥样硬化性心脏病的方法，根据血清棕榈酸和油酸的浓度比例的不同确定正常人群(肥胖指数BMI＜25)，肥胖人群(肥胖指数BMI＞25)，不肥胖的CAD患者及肥胖的CAD患者(肥胖指数BMI＜25)的诊断范围及诊断率。本专利技术与现有技术相比，其显著性进步表现在能针对性的对CAD的易感高危人群肥胖人群提供快速，便捷，准确的预防及诊断，采用本方法对该病的早期诊断及辅助诊断提供了一条便利快捷的途径。四附图说明图1标准品的气相色谱分析图谱。图谱中有两个主峰，分别对应16碳的棕榈酸和18碳油酸，1∶1浓度比配制的棕榈酸和油酸经衍生化和萃取后进行气相色谱分析，最终所得二者的峰面积比为1∶0.563133。图2人血清样品的气相色谱分析图谱。人血清样品经衍生化并萃取后得到脂肪酸甲酯化的产物进行气相色谱分析，得到血清自由脂肪酸图谱，能够找到和标准品对应的棕榈酸和油酸的特征峰，通过比较其峰面积比来确定其浓度比例。图3四组人群血清中棕榈酸和油酸比值(PA/OA)的测定。正常人群组n＝13，肥胖人群组n＝14，不肥胖的CAD患者组n＝13，肥胖的CAD患者组n＝13。每个样例取两次血清，每次血清样品测三次，统计六次结果计算平均值及标准偏差，并将平均值作为此样例血清中棕榈酸和油酸比值的最终值。五具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的阐述，但不对其有任何限制。样品搜集血清样品由南京大学附属医院鼓楼医院心胸外科提供。材料与试剂试剂色谱纯棕榈酸和油酸购于美国Sigma公司，分析纯浓硫酸购于，分析纯甲醇，分析纯氯仿及无水硫酸钠购于天津化学试剂一厂。器本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种气相色谱法测定人血清棕榈酸和油酸浓度比的方法，其特征是将人血清样品衍生化处理后，用气相色谱仪测定其游离的棕榈酸和油酸浓度的比例。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张燕，王强，张辰宇，项阳，孙凌冰，徐威，姜晓宏，王东进，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]