定位显微术中定位信号源的方法技术

本发明专利技术涉及定位信号源(3.1、3.2)的定位显微术方法。在此，至少一次对于检测器(2)的各个像素(1)，误差参数的值被确定并且以分配到相关像素(2)的方式储存在校准数据记录中。捕获的图像数据用于标识信号源(3.1、3.2)的起源区域(4)，并将点扩展函数拟合到相应的起源区域(4)的像素值。基于点扩展函数定位相应的信号源(3.1、3.2)。可以将各个像素(1)的像素特定的误差参数与阈值进行比较。如果超过阈值，则当拟合点扩展函数时忽略这些像素(1)或是通过插值替换这些像素(1)。附加地或替代地，基于求导的像素特定的误差参数来确定和校正像素(1)的真实噪声性能。

【技术实现步骤摘要】
定位显微术中定位信号源的方法
本专利技术涉及根据一种定位信号源的定位显微术方法。
技术介绍
从现有技术中已知各种定位显微术方法。突出的示例是根据简称PALM”(光激活的定位显微术；例如WO2006/127692A2)或“STORM”(随机光学重构显微术；US2008/0032414A1)所指代的方法来定位单独信号源，特别是单独发射体的方法。作为示例，定位显微术的概述记载在Klein等人2014年的(Klein，T.等人于2014年在《组织化学和细胞生物学》第141卷：第561-575页的《单分子定位显微术的八年(Eightyearsofsinglemoleculelocalizationmicroscopy)》)，以及Babcock等人2012年的(Babcock，H.等人于2012年在《光学纳米显微术》第1卷：第6页的《随机光学重构显微术的高密度3D定位算法(Ahigh-density3Dlocalizationalgorithmforstochasticalopticalreconstructionmicroscopy)》)的文章中。已知的定位显微术方法的共同点是，它们从用作检测器或相机的像素型2D面传感器中获取定位信号源(发射体、发射分子)的信息。需要非常灵敏的检测器，因为各个定位步骤只有几百个到几千个光子可用来定位单独信号源，例如单独发射分子。作为示例，这样的灵敏的检测器例如是EMCCD(电子倍增电荷耦合器件)传感器。然而，作为EMCCD传感器基础的CCD架构因具有串行读取和增益过程而导致像素数目有限和/或读取速度受限。作为替代例，近年来，已经建立了所谓的科学CMOS”或sCMOS(CMOS＝互补金属氧化物传感器)传感器。它们统一了“有源像素传感器”架构，可能因为CMOS技术具有非常低的读出噪声和高量子效率。sCMOS传感器相对于常规的EMCCD相机的优点包括：帧率高、像素数目多和像素较小。此外，因为在sCMOS传感器中没有电子倍增，因此没有所谓的多余噪声。最终，这导致有效量子效率更高。因此，sCMOS传感器同样地适合在定位显微术中使用。在此，对于作为辐射源的单独发射体的定位准确度而言，单独像素的信号行为中可能的不均匀性是不利的。虽然这样的信号不均匀性会在正常成像中导致受干扰的图像印象作为最坏情况，但是在定位显微术的定位步骤期间，这些信号不均匀性可能会导致指向错误的定位。特别地，这样的不均匀性可能是由于已经提到的“有源像素传感器”架构。专利US9,769,399B2和Huang等人于2013年的技术论文(Huang，F等人于2013年在《自然方法》第10卷：第653-658页的《使用sCMOS相机特定的单分子定位算法的视频率纳米显微术(Video-ratenanoscopyusingsCMOScamera-specificsinglemoleculelocalizationalgorithms)》)描述了使用参数化模型来建模噪声性能。在此，与像素有关的噪声被建模为高斯分布。作为示例，建模的参数是每像素的高斯分布的平均值(偏移)、分布的方差和/或增益。作为示例，偏移可以借助于捕获多个暗图像来确定。尽管缺少检测辐射(暗噪声；错误信号)，但是这些暗图像仍可用于确定由像素生成的信号。作为示例，可以由该数据形成平均值，并且可以将该平均值用作误差参数。该增益可以借助于用不同的已知光子数或照明水平捕获和评估多个图像来确定。从所捕获的图像数据出发，可以确定各个像素的像素值的分布函数，其中例如利用光子诱导的方差(“散粒噪声”)与高斯方差之和。然而，这样的校正噪声性能的方法的缺点在于，与相应模型显著偏离的单独像素可能导致显著的误差。作为这样的像素的示例，指定了所谓的“闪烁体”，它可以导致随机输出信号(Wang，X.等人于2006年在电子装置会议；IEDM′06，国际IEEE2006的《CMOS图像传感器像素中的随机电报信号(RandomtelegraphsignalsinCMOSimagesensorpixels)》)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种定位信号源的定位显微术方法，由此减少现有技术中出现的缺点。该目的通过定位信号源的定位显微术方法来实现，其中，至少一次对于用于捕获检测辐射的检测器的各个像素，像素特定的误差参数的值被确定且以分配给相关像素的方式储存在校准数据记录中。将样品的图像数据逐个像素地捕获作为图像数据记录中的像素值，并且基于所捕获的图像数据标识信号源的起源区域，所述起源区域包括多个像素。将点扩展函数(下文也缩写为PSF)拟合至相应的起源区域的各像素的像素值。相应的信号源被定位，即，基于PSF在相关起源区域内在2D和/或3D中确定原点。根据本专利技术，在校准数据记录内并且对于各个像素，将像素特定的误差参数与预先设定的阈值比较。在校准数据记录中标记像素特定的误差参数的值大于阈值的各个像素。当将PSF拟合到相应的起源区域的像素值时，图像数据记录中的所有或某些标记的像素被忽略或通过插值替换。附加地或替代地，可以在方法中基于校准数据记录针对每个像素确定求导的像素特定的误差参数，以代替像素特定的误差参数，和/或创建多个像素值的ADU(模拟转数字单元)直方图。基于求导的误差参数或基于相应的ADU直方图来拟合PSF。在本说明书的含义内的像素应被理解为检测器的检测器元件，例如sCMOS传感器的检测器元件。该检测器具有多个检测器元件，其特别是设置成二维矩阵或阵列。将校准测量期间捕获的像素值储存在校准数据记录中，并且可选地，以分配给相应的像素的方式将相应的像素特定的和/或求导的像素特定的误差参数储存在其中。图像数据记录包含各个像素的像素值形式的图像数据，这些图像数据在图像捕获期间被捕获，例如作为PALM或STORM方法中的原始数据。可以将各个校准数据记录或从中求导的数据记录附加到图像数据记录，例如作为元数据。以这样的方式，例如还可以在图像数据记录中标记出校准数据记录中所标记的像素。图像数据记录的像素值的插值可以使用已知的方法来实现，例如借助于回归方法、估计和/或平均值或中值的形成。像素特定的误差参数是由相关像素输出的信号，该信号不是由于捕获的检测辐射而是由于因环境和/或部件的不同影响而产生的。由于周围环境，这样的错误信号可能由检测器的温度以及检测器的温度改变导致。由于部件，错误信号可能会例如由检测器的半导体材料中存在缺陷区域而产生(Wang，X.等人于2006年在电子装置会议；IEDM′06，国际IEEE2006的《CMOS图像传感器像素中的随机电报信号(RandomtelegraphsignalsinCMOSimagesensorpixels)》)。即使实际上没有捕获到一个光子或者捕获到比相关像素的灵敏度所需的光子更少的光子，但是像素的错误信号也会传输至少一个光子的捕获。像素特定的误差参数，其例如在下文中也简称为误差参数，例如是指所谓的偏移、像素值(特别是时间序列)的方差、和增益。与阈值比较的像本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定位信号源(3.1、3.2)的定位显微术方法，其中：/n至少一次对于用于捕获检测辐射的检测器(2)的各个像素(1)，像素特定的误差参数的值被确定，且以分配给相关像素(1)的方式储存在校准数据记录中；/n将样品的图像数据逐个像素地捕获作为像素值，且储存在图像数据记录中；/n基于捕获的图像数据标识信号源(3.1、3.2)的起源区域(4)，所述起源区域包括多个像素(1)；/n将点扩展函数拟合到相应的起源区域(4)的像素值；和/n相应的信号源(3.1、3.2)基于所述点扩散函数定位在相关起源区域(4)内；/n其特征在于，/n对于各个像素(1)，将所述像素特定的误差参数与阈值进行比较；/n在所述校准数据记录中标记所述像素特定的误差参数的值大于所述阈值的各个像素(1)；以及/n当拟合所述点扩展函数时，所述图像数据记录中的标记的像素(1)被忽略或通过插值替换。/n

【技术特征摘要】
20190322 DE 102019203923.51.一种定位信号源(3.1、3.2)的定位显微术方法，其中：
至少一次对于用于捕获检测辐射的检测器(2)的各个像素(1)，像素特定的误差参数的值被确定，且以分配给相关像素(1)的方式储存在校准数据记录中；
将样品的图像数据逐个像素地捕获作为像素值，且储存在图像数据记录中；
基于捕获的图像数据标识信号源(3.1、3.2)的起源区域(4)，所述起源区域包括多个像素(1)；
将点扩展函数拟合到相应的起源区域(4)的像素值；和
相应的信号源(3.1、3.2)基于所述点扩散函数定位在相关起源区域(4)内；
其特征在于，
对于各个像素(1)，将所述像素特定的误差参数与阈值进行比较；
在所述校准数据记录中标记所述像素特定的误差参数的值大于所述阈值的各个像素(1)；以及
当拟合所述点扩展函数时，所述图像数据记录中的标记的像素(1)被忽略或通过插值替换。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于检测辐射的波长、所述检测辐射的强度和/或所述检测器(2)的温度，设定所述阈值。


3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于，平均地，在各个起源区域中标记预先确定的最大数目的像素(1)。


4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，使用所述校准数据记录来校正未标记的像素(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：T卡尔克布伦纳，Y诺维考，M贝克，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE