一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法及处理试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法及处理试剂盒。所述方法包括(1)胶内酶解：将蛋白质凝胶电泳的待检测泳道部分细碎化后，经洗涤、蛋白质还原处理、蛋白质烷基化处理、蛋白酶酶解处理后，采用酸性乙腈溶液进行肽段抽提，获得肽段‑酸性乙腈溶液；(2)肽段脱盐：将肽段‑乙腈溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的反相色谱填料的分离柱，采用质量分数0.1％‑0.5％的三氟乙酸进行脱盐洗涤，并采用碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，作为质谱检测进样样品。所述包括：肽段抽提液、脱盐清洗液、以及脱盐洗脱液。本发明专利技术降低了对实验条件的要求，并且缩短样品制备时间至一半左右。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法及处理试剂盒
本专利技术属于蛋白质组学检测
，更具体地，涉及一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法及处理试剂盒。
技术介绍
目前制备用于质谱检测的蛋白质样本，一般是将凝胶电泳分离后的蛋白质凝胶样品进行胶内酶解和脱盐处理后，进行质谱检测。质谱检测的前处理包括以下步骤：首先切碎胶块，依次以二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)对蛋白进行还原和烷基化处理，然后胰酶酶解后提取肽段溶液；在此之后需要以真空离心浓缩仪抽干肽段溶液，再用酸性溶液溶解肽段实现溶剂置换后，转移至C18分离柱进行脱盐，最后以高有机相洗脱肽段以备质谱检测。目前的蛋白质质谱检测的前处理过程，步骤繁多，尤其需要用到真空离心浓缩仪等常规实验室所不配置的仪器，整个制样过程消耗时间在20至30小时之间，同时由于仪器的配置问题，有可能需要转运蛋白质或者肽段样本至具有相应条件的实验室，带来严重的保存及转运问题。因此不利于规模化、商业化的检测。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法及处理试剂盒，其目的在于通过采用阳离子交换作用的反相色谱填料进行脱盐，无需溶剂置换即可实现肽段脱盐步骤，避免了采用真空离心浓缩仪进行溶剂抽干步骤，降低了对实验条件的要求，大幅缩短了蛋白质凝胶质谱检测样品的制备时间，由此解决现有技术蛋白质质谱检测样品对实验条件要求较高、处理时间长的技术问题。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)胶内酶解：将蛋白质凝胶电泳的待检测泳道部分细碎化后，经洗涤、蛋白质还原处理、蛋白质烷基化处理、蛋白酶酶解处理后，采用酸性乙腈溶液进行肽段抽提，获得肽段-酸性乙腈溶液；所述酸性乙腈溶液，含有3％至10％的甲酸，乙腈浓度在50％至80％之间；(2)肽段脱盐：将步骤(1)获得的肽段-乙腈溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的反相色谱填料的分离柱中，采用质量分数0.1％-0.5％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，并采用碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，作为质谱检测进样样品。优选地，所述蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，所述反相色谱填料，具有阳离子交换作用，当溶液pH值呈酸性，肽段带有正电荷从而与反相色谱填料稳固吸附，进行脱盐洗涤后，通过洗脱液改变环境pH值，使得肽段不再带有正电荷，从而溶解在呈碱性的洗脱液中被洗脱，优选的反相色谱填料为SDB-RPS反相色谱填料，是一种用磺酸基修饰的苯乙烯-二乙烯苯共聚物。优选地，所述蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其所述碱性乙腈溶液，含有1％-3％的NH4OH，乙腈浓度在60％至90％之间。优选地，所述蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其所述采用三氟乙酸进行脱盐洗涤的操作具体为：加入120-180μL含有0.1％-0.5％的三氟乙酸溶液至吸附有待脱盐肽段的分离柱，过柱后弃液；优选洗涤操作重复1至3次；所述采用碱性乙腈溶液洗脱的操作具体为：加入15-20μL的碱性乙腈溶液至吸附有已脱盐肽段的分离柱，过柱后收集液相；优选洗脱操作重复2至3次。优选的，所述分离柱包含于肽段除盐装置。所述肽段除盐装置由可拆卸嵌套的分离柱、适配器和收集管组成。所述分离柱为两端开口的锥形管，距离下端3至8mm处填充有反相色谱填料；所述收集管，可采用1.5mL的离心管；所述分离柱和收集管通过适配器同心固定，所述适配器为中心具有锥形通孔且与收集管配合的收集管盖，所述锥形通孔与分离柱配合，使得分离柱与收集管同心固定，且分离柱一端暴露在适配器外，一端处于收集管内部。优选的，所述适配器具有通气孔，用于平衡收集管内外气压。优选所述脱盐洗涤的操作和所述洗脱的操作过柱步骤，采用所述肽段除盐装置，并采用离心力加速液体过柱，优选采用1000g-3000g离心1-3min。优选地，所述蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其步骤(1)所述蛋白质还原处理和蛋白质烷基化处理按照以下方法同时进行蛋白质还原和烷基化处理：加入凝胶体积1至3倍的还原烷基化反应液，50℃-95℃孵育20-60min；所述还原烷基化反应液含有还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)、以及烷基化剂氯乙酰胺(CAA)，其中TCEP浓度在5-30mM之间，CAA浓度在20-100mM之间，优选向胶块中加入2倍胶块体积的还原烷基化反应液，56℃孵育30min，所述还原烷基化反应液含有10mMTCEP和40mMCAA的水溶液。按照本专利技术的另一个方面，提供了一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理试剂盒，其包括：肽段抽提液、脱盐清洗液、以及脱盐洗脱液；所述肽段抽提液，为酸性乙腈溶液，乙腈浓度在50％至80％之间，乙腈浓度优选为60％；含有3％至10％的甲酸，甲酸浓度优选5％；所述脱盐清洗液，为0.1％-0.5％的三氟乙酸进行脱盐洗涤，优选为0.2％的三氟乙酸溶液；所述脱盐洗脱液，为碱性乙腈溶液，乙腈浓度在60％至90％之间，乙腈浓度优选80％；含有1％-3％的NH4OH，NH4OH浓度优选1.25％；所述肽段抽提液、脱盐清洗液、以及脱盐洗脱液的体积比为：1:0.5-1.5:0.05-0.2。优选地，所述蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理试剂盒，其还包括：还原烷基化反应液，所述还原烷基化反应液与所述肽段抽提液的体积之比在0.2-0.5:1；所述还原烷基化反应液含有还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)、以及烷基化剂氯乙酰胺(CAA)，其中TCEP浓度在5-30mM，CAA浓度在20-100mM。优选地，所述蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理试剂盒，其还包括：乙腈水溶液、胰酶稀释液、去离子水、乙腈和胰蛋白酶；乙腈水溶液、胰酶稀释液、去离子水、乙腈和肽段抽提液的体积比为：5-20:0.3-0.9:2-4:4-8:1；所述乙腈水溶液为100mMNH4HCO3/50％乙腈溶液；所述胰酶稀释液为pH值在7.8-8.5，50mMNH4HCO3溶液，用于溶解胰蛋白酶并配制胰蛋白酶酶浓度为0.005-0.02μg/μL的酶解反应液。优选地，所述蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理试剂盒，其还包括：由可拆卸嵌套的分离柱、适配器和收集管组成的肽段除盐装置。所述分离柱为两端开口的锥形管，距离下端3至8mm处填充有反相色谱填料；所述收集管，可采用1.5mL的离心管；所述分离柱和收集管通过适配器同心固定，所述适配器为中心具有锥形通孔且与收集管配合的收集管盖，所述锥形通孔与分离柱配合，使得分离柱与收集管同心固定，且分离柱一端暴露在适配器外，一端处于收集管内部。优选，所述适配器具有通气孔，用于平衡收集管内外气压。所述反相色谱填料，具有阳离子交换作用，当溶液pH值呈酸性，肽段带有正电荷从而与反相色谱填料稳固吸附，进行脱盐洗涤后，通过洗脱液改变环境pH值，使得肽段不再带有正电荷，从而溶解在呈碱性的洗脱液中被洗脱，优选的反相色谱填料为SDB-RPS反相色谱填料本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)胶内酶解：将蛋白质凝胶电泳的待检测泳道部分细碎化后，经洗涤、蛋白质还原处理、蛋白质烷基化处理、蛋白酶酶解处理后，采用酸性乙腈溶液进行肽段抽提，获得肽段-酸性乙腈溶液；所述酸性乙腈溶液，含有3％至10％的甲酸，乙腈浓度在50％至80％之间；/n(2)肽段脱盐：将步骤(1)获得的肽段-乙腈溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的反相色谱填料的分离柱，采用质量分数0.1％-0.5％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，并采用碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，作为质谱检测进样样品。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)胶内酶解：将蛋白质凝胶电泳的待检测泳道部分细碎化后，经洗涤、蛋白质还原处理、蛋白质烷基化处理、蛋白酶酶解处理后，采用酸性乙腈溶液进行肽段抽提，获得肽段-酸性乙腈溶液；所述酸性乙腈溶液，含有3％至10％的甲酸，乙腈浓度在50％至80％之间；
(2)肽段脱盐：将步骤(1)获得的肽段-乙腈溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的反相色谱填料的分离柱，采用质量分数0.1％-0.5％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，并采用碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，作为质谱检测进样样品。


2.如权利要求1所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，所述反相色谱填料，具有阳离子交换作用，当溶液pH值呈酸性，肽段带有正电荷从而与反相色谱填料稳固吸附，进行脱盐洗涤后，通过洗脱液改变环境pH值，使得肽段不再带有正电荷，从而溶解在呈碱性的洗脱液中被洗脱，优选的反相色谱填料为SDB-RPS反相色谱填料，是一种用磺酸基修饰的苯乙烯-二乙烯苯共聚物。


3.如权利要求1所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，所述分离柱可被包含于肽段除盐装置中。所述肽段除盐装置，由可拆卸嵌套的分离柱、适配器和收集管组成。所述分离柱为两端开口的锥形管，距离下端3至8mm处填充有反相色谱填料；所述收集管，可采用1.5mL的离心管；所述分离柱和收集管通过适配器同心固定，所述适配器为中心具有锥形通孔且与收集管配合的收集管盖，所述锥形通孔与分离柱配合，使得分离柱与收集管同心固定，且分离柱一端暴露在适配器外，一端处于收集管内部。优选，所述适配器具有通气孔，用于平衡收集管内外气压。


4.如权利要求1所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，所述碱性乙腈溶液，含有1％-3％的NH4OH，乙腈浓度在60％至90％之间。


5.如权利要求1所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，所述采用三氟乙酸进行脱盐洗涤的操作具体为：加入120-180μL含有0.1％-0.5％的三氟乙酸溶液至吸附有待脱盐肽段的分离柱，过柱后弃液；优选洗涤操作重复1至3次；
所述采用碱性乙腈溶液洗脱的操作具体为：加入15-20μL的碱性乙腈溶液至吸附有已脱盐肽段的分离柱，过柱后收集液相；优选洗脱操作重复2至3次。
优选所述脱盐洗涤的操作和所述洗脱的操作过柱步骤，采用所述可拆卸嵌套的分离柱、适配器和收集管组成的肽段除盐装置，并采用离心力加速液体过柱，优选采用1000g-3000g离心1-3min。


6.如权利要求1所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白质还原处理和蛋白质烷基化处理按照以下方法同时进行蛋白质还原和烷基化处理：
加入凝胶体积1至3倍的还原烷基化反应液，50℃-95℃孵育20-60min；所述还原...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚骏，陈希，刘宜子，陈继锋，许梦玲，韩强强，杜博贾，
申请(专利权)人：谱度众合武汉生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42