调节G蛋白偶联受体活性的化合物的筛选方法技术

本发明专利技术涉及用于筛选ＧＰＣＲｓ的调节剂的系统。此外它涉及用于在真核宿主细胞中异源表达异源二聚体Ｇ蛋白偶联受体（ＧＰＣＲｓ）的重组载体系统。其中也包含了优选情况下感受甜味和Ｌ－氨基酸味道的工程化ＧＰＣＲｓ的功能性表达，或更优选情况下还包括该受体在鉴定功能性配体中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于鉴定选定的G蛋白偶联受体(GPCRs)的调节剂(刺激剂和拮抗剂)的筛选方法，从而鉴定调节剂。在本专利技术的优选实施方案中，这些调节剂可以是调味剂。本专利技术还涉及用于在真核宿主细胞中稳定、异源地表达选定的异源二聚体G蛋白偶联受体的重组载体系统。本文中公开了工程化GPCRs的功能性表达用于感受甜味和L-氨基酸的味道，以及该受体在鉴定功能性配体中的应用。在本说明书中，引用了大量文件。这些文件、包括制造商的手册和专利申请或专利的内容，在此以其全文引为参考。GPCRs代表了最大的细胞表面受体家族，在人类基因组中据估计有多达1000个基因，它们的主要特征是具有七次跨膜的构型(Bockaert和Pin，1999；Pierce等，2002)。GPCRs可以被多种不同的配体激活，包括肽、蛋白质、脂类、小分子、离子甚至光子。被活化的GPCRs改变了其构象，使其能够催化与GPCR偶联的异源三聚体G蛋白的α亚基上鸟苷二磷酸(GDP)与鸟苷三磷酸(GTP)的交换。异源三聚体G蛋白由18种不同的α亚基中的一种、5种不同的β亚基中的一种以及11种不同的γ亚基中的一种组成，通常按照它们的α亚基的性质进行分类，一般来说分为四种主要的类别Gs，它能够活化腺苷环化酶；Gi，它能够抑制腺苷环化酶；Gq，它能够活化磷脂酶C；以及G12/13，其具有异源的功能。除了α亚基依赖性信号传导之外，β/γ亚基本身也可以用作信号传导分子。如果考虑到这些受体可以以同源寡聚体或异源寡聚体复合物的形式存在的话，GPCR依赖性信号传导将变得更加复杂(George等，2002；Milligan等，2003；Salahpour等，2000)。因此，GPCRs负责调控广范围的不同的生理过程，这并不令人吃惊。最近，GPCRs在人类的感觉例如视觉、嗅觉和味觉中的作用成为深入研究的主题。尽管GPCR视紫红质参与视觉感受感受是近30年来了解得最充分的G蛋白偶联受体信号传导的例子之一(Maesa等，2003)，GPCRs在嗅觉和苦味以及甜味味觉中的作用在20世纪90年代才被发现(Buck和Axel，1991；Firestein，2001；Lindemann，1996b；Lindemann，2001)。在味觉感受中GPCR信号传导的发现与脊椎动物味觉细胞中味觉特异性信号传导的发现有紧密的联系。在电生理学和生物化学研究中，显然味觉衍生的信号传导导致了典型的GPCR依赖性第二信使的诱导，例如环核苷(cAMP，cGMP)、肌醇三磷酸(IP3)或钙(Kinnamon和Cummings，1992；Kinnamon和Margolskee，1996；Lindemann，1996a)。GPCRs参与味觉感受被脊椎动物味觉细胞中特异性表达的G蛋白味导素导素(gustducin)的发现进一步证实(McLaughlin等，1992；Wong等，1996)。另一方面，从基因工程小鼠的研究中已经知道，感受例如糖精的甜味的能力与小鼠4号染色体上所谓的sac位点有关(Bachmanov等，2001；Lush，1989；Lush等，1995)。基于这些数据，显然可以在味觉细胞衍生的缩减的cDNA文库中搜索GPCR序列标签，或者通过进行基因组序列扫描来进一步缩小小鼠sac位点的范围，以鉴定GPCR类似物作为推测的味觉受体。这两种方法导致发现了大鼠、小鼠和人类的味觉GPCRs受体DNA序列T1R1和T1R2(Hoon等，1999；Hoon和Ryba，1997)以及T1R3(Kitagawa等，2001；Li等，2001；Max等，2001；Montmayeur等，2001；Sainz等，2001)。同源性比对显示出这些味觉受体例如同源二聚体代谢型谷氨酸受体(mGluR)、异源二聚体γ氨基丁酸B型受体(GABABR)和同源二聚体细胞外钙受体，是C类GPCRs小家族的成员。大多数C类受体的共同特点是表现出大的细胞外氨基末端结构域，由所谓的捕蝇夹模块(VFTM)和富含半胱氨酸的结构域(CRD)组成，该CRD将VFTM与七螺旋结构域相连(Pin等，2003)。此外，对于这些C类受体中的几种，已经描述了同源或异源的寡聚化现象(Bai等，1998；Kaupmann等，1998；Kunishima等，2000；White等，1998)。因此，对于推测的甜味受体T1R1、T1R2和T1R3试验了C类受体的GPCR寡聚化特征。通过在真核细胞系统中进行重组异源表达，通过钙成像证实了人工偶联的G蛋白依赖性信号传导级联系统的功能性表达和味觉特异性的活化。T1R受体集合起来装配成功能性味觉受体。几项研究的结果显示出异源二聚体T1R1/T1R2起谷氨酸(unami)和L-氨基酸受体的作用，而异源二聚体T1R1/T1R3起高亲和性的糖和人工甜味剂受体的作用。具体来说，T1R1和T1R3的异源二聚体共表达产生的味觉受体对鲜味和谷氨酸单钠刺激作出反应，而T1R2和T1R3的异源二聚体共表达产生的味觉受体对甜味刺激例如各种糖(例如葡萄糖和蔗糖)、人工甜味剂(例如acesulfam K、cyclamat、糖精)和甜味导素例如应乐果甜蛋白(monellin)、奇异果甜蛋白(thaumatin)、植物甜蛋白(brazzein)作出反应(Li等，2002；Nelson等，2002；Nelson等，2001；Zhao等，2002)。对于感受苦味的GPCRs的鉴定也可以产生类似的报告，只是到目前为止，尚未报道这些所谓的T2R-GPCRs的同聚或寡聚化(Meyerhof等，2005)。上面讨论的为负责例如味觉感受的受体编码的基因的鉴定、以及将该基因克隆到适当的载体中用于在真核细胞中表达该蛋白、和用该载体转化该细胞以提高用于GPCR调节剂、即上面详细描述的受体的刺激剂和拮抗剂的筛选系统和/或筛选方法可以在合理的时间内容易地开发出来的期望值。这可以从本领域内大量的和仍然在增长的专利申请的数量反映出来。T1R1的克隆被公开在不同的专利申请中，例如在WO03/025137、WO00/06952(它在其中被命名为GPCR-B3)、US020040191862A1和WO2005/033125中。TIR2的克隆被公开在专利申请WO 03/025137、US020040191862A1和US020030040045A1中。T1R3的克隆被公开在专利申请WO 03/025137、WO 03/025137、US020040191862A1和US020030040045A1中。用于在真核细胞中表达该蛋白的系统被公开在专利申请WO03/025137、WO 00/06952、US020040191862A1、WO2004069191和US20030040045A1中。用于推测的味道调节剂的筛选系统被公开在专利申请WO/00/06952、WO2004069191和US200300400451A1中。但是，关于利用这样的筛选方法/系统成功地鉴定新的调节剂、例如新的人工味道调节剂例如新的甜味剂，尚未有报导。目前，在发达国家中正在进行的关于肥胖的争论和消费者逐渐增长的健康意识，导致了对与完全用糖类例如蔗糖、葡萄糖、果糖或糖浆例如HFCS 55或42增甜的产品相比含有本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定ＧＰＣＲｓ的调节剂的方法，包括下列步骤：　　　　ａ、用为一种或多种ＧＰＣＲ（ｓ）编码的基因序列转化真核宿主细胞，　　　　ｂ、将转化的宿主细胞在足够使该一种或多种ＧＰＣＲｓ功能性表达的条件下进行培养，　　　　ｃ、将培养的以功能性方式表达一种或多种ＧＰＣＲｓ的宿主细胞与选定的一种或多种ＧＰＣＲｓ的潜在调节剂相接触，　　　　ｄ、测量转化的宿主细胞在接触潜在的调节剂时产生的选定的细胞反应，以及　　　　ｅ、选择诱导特异性反应的鉴定物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔克罗恩，霍尔格津克，
申请(专利权)人：努特诺瓦营养产品及食品成分有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]