一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种碱性磷酸酶活性检测用试剂盒及快速检测方法，所述试剂盒包括显色试剂和标准比色卡，所述显色试剂为酚酞磷酸钠显色试剂或磷酸苯二钠显色试剂。所述试剂盒可以应用于乳品碱性磷酸酶活性检测。本发明专利技术还提供快速半定量检测碱性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：(1)配制显色试剂溶液；(2)在显色溶液中加入待测样品，水浴加热；(3)常温静置后将显色结果与标准比色卡对比，快速判断样品中ALP的浓度活性范围以及是否存在渗入生乳，并由此判断致病微生物的灭活程度或加工过程中生乳的渗入污染情况。本发明专利技术的检测试剂盒成分简单，便于携带，使用方便，可以快速筛查检测乳品的灭菌情况。

【技术实现步骤摘要】
一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于食品质量快速检测
，具体涉及一种用于检测牛奶中碱性磷酸酶活性的试剂盒及检测方法。
技术介绍
生乳中微生物及致病菌作为评价牛奶质量安全的一个重要指标，其含量直接影响乳制品的质量安全。微生物含量越高，越容易引起牛奶腐败变质，甚至会造成巴氏杀菌失败，使产品乳中细菌超标。根据各国国情及自身乳品安全的需要，关于生乳中微生物检测限量以及项目的规定各不相同。我国现行的生乳卫生标准是2010年修改并颁布的《食品安全国家标准-生乳》，其中将生乳中菌落总数指标从旧版4×106CFU/g(mL)调整为2×106CFU/g(mL)，提高了生乳的收购门槛。美国食品药品管理局(FDA)对生乳菌落总数的限量要求设置为5×105CFU/mL。欧盟ECNo.1662/2006关于食品微生物法规规定了生鲜牛乳中和其他动物生乳的菌落总数应分别小于1×105和1.5×106CFU/mL，欧盟ECNo.1441/2007关于食品微生物法规又规定生乳和即食生乳中菌落总数分别小于1.5×106和5×105CFU/mL。澳大利亚和新西兰《食物中的微生物限量》中规定，生乳中SPC应低于2.5×104CFU/mL，沙门氏菌、空肠弯曲菌不得检出，大肠菌群低于103CFU/mL，大肠杆菌低于9CFU/mL，李斯特氏菌在即食食品中不得检出。中国台湾地区现行的《生奶CNS3055-2015》标准规定，生乳中菌落总数的限量为1×105CFU/mL。碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP，EC3.1.3.1)是自然界中普遍存在的一种酶，在牛乳中主要缔合在乳脂肪球膜上(MFGM)。ALP是一种热稳定性较好的酶，其热稳定性要略高生乳中其他致病微生物。因此，当牛乳热处理后，其活性的大幅降低，也标志着牛乳中其他致病微生物的灭活。这一特性可以使ALP作为巴氏杀菌乳热处理效果的标志物，即当ALP检测结果呈阳性时，可认为乳品巴氏杀菌不彻底，或者有生乳渗入污染。为了保证乳及乳制品的卫生安全，不同国家、地区和组织分别制定了关于ALP的限量标准。目前，本领域常用的ALP检测方法有比色法、荧光法和发光法。上述方法作为精准检测技术手段，具有较高的灵敏度，但都需要相应的专用仪器设备、相对复杂的操作步骤、较长的测定时间等，难以适用乳品生产过程中快速、简便的需求。同时，碱性磷酸酶存在复活现象，即牛乳在加热处理后即可检测为ALP阴性，但是经过一段时间后又变成阳性。研究发现，将乳加热到84℃或将稀奶油加热到74℃会发生ALP的复活。复活的最适储存温度是30℃，在此温度下储存6小时即可检测到ALP复活。在一定条件下发生的ALP复活使检测结果的解读变得复杂，容易造成假阳性。乳品是否合格，碱性磷酸酶只是其中的一个指标，还要综合菌落总数等指标才能确定其是否杀菌合格，但是为了达到快速筛查的目的，即快速锁定不合格乳品或确定生产线是否存在生乳渗漏污染，可以单独使用ALP作为指标进行快速判断。这时，ALP的检测不要求高精度，但要求阳性时定性准确。因此，需要一种简单有效的快速检测技术来判定乳品的杀菌程度，以及是否被生乳渗漏污染，并提高大批量样品同时检测的效率和降低检测成本。
技术实现思路
为了改善上述缺陷，本专利技术提供一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒以及快速检测方法。本专利技术的第一方面，提供一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒，包括标准比色卡和显色试剂。根据本专利技术，所述显色试剂包含酚酞磷酸钠或者磷酸苯二钠中的一种，例如选自包含酚酞磷酸钠或磷酸苯二钠的显色试剂。根据本专利技术，所述标准比色卡包含至少两个颜色深浅不同的色块，例如包含5-10个色块，优选7个、8个或9个色块。根据本专利技术，所述标准比色卡各个色块对应于不同的ALP标准活性浓度或生乳比例。根据本专利技术，所述标准比色卡采用如下方法制作：采用不含ALP或ALP已完全失活的液态乳(例如UHT乳)，加入不同活性浓度的ALP标准品或者不同比例的生乳，形成含有不同活性浓度的ALP或生乳比例标准品乳样，向该系列乳样中加入显色试剂，进行显色反应，得到不同浓度ALP或生乳比例显示的色彩，将其显示的色彩定为比色卡的标准色，标注对应颜色下的ALP活性浓度或生乳比例即得标准比色卡。进一步地，所述ALP标准品的浓度或加入生乳的比例以梯度递增。例如，所述梯度递增是以倍数递增，例如以1倍、2倍、3倍的浓度倍数递增。根据本专利技术，所述包含酚酞磷酸钠的显色试剂包括氨水、氯化铵、酚酞二磷酸四钠和水。根据本专利技术，所述包含酚酞磷酸钠的显色试剂为所述酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液的酚酞磷酸钠溶液，其中所述NH3-NH4Cl缓冲溶液由所述氨水、氯化铵和水配制而成。根据本专利技术，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂包括2,6-二溴苯醌氯亚胺、Na2CO3、磷酸苯二钠、乙醇、硼酸盐缓冲液和水。根据本专利技术，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂中，由所述磷酸苯二钠、硼酸盐缓冲液配制磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质，所述2,6-二溴苯醌氯亚胺和乙醇配制成Gibb酚试剂，所述Na2CO3和水配制为Na2CO3溶液。根据本专利技术，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂进一步包括正丁醇。根据本专利技术，所述试剂盒包括至少一个棕色试剂瓶。根据本专利技术，所述试剂盒包括标准比色卡使用方法，优选地，所述试剂盒包括说明书。本专利技术的第二方面，提供如第一方面所述试剂盒在乳品碱性磷酸酶活性检测中的应用，所述检测为半定量检测。本专利技术的第三方面，提供一种快速半定量检测碱性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：将显色试剂与待测样品接触，进行显色反应，将显色结果与指示ALP活性浓度或生乳比例的标准比色卡对比，确定样品中ALP活性浓度或生乳比例的范围。根据本专利技术的方法，所述显色试剂为包括酚酞磷酸钠的显色试剂或者包括磷酸苯二钠的显色试剂。根据本专利技术的方法，所述显色反应在水浴中进行；优选地，所述水浴温度为36-44℃，例如38-42℃，再例如为40℃。根据本专利技术的方法，所述包括酚酞磷酸钠的显色试剂为酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液形成的酚酞磷酸钠溶液。根据本专利技术，所述酚酞磷酸钠溶液的浓度为0.5-1.5g/L，更优选0.8-1.2g/L。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述酚酞磷酸钠溶液的浓度为1g/L。根据本专利技术的方法，所述NH3-NH4Cl缓冲溶液的pH为9.0-10.0，优选9.8。根据本专利技术的方法，所述加入待测样品的酚酞磷酸钠溶液的体积比为0.5-4:1，优选1-2:1；在本专利技术的一个具体实施方式中，二者体积比为1:1。根据本专利技术的方法，所述酚酞磷酸钠溶液在0-6℃下避光保存。优选地，所述试剂盒于制备后180天内使用。根据本专利技术的方法，所述包括磷酸苯二钠的显色试剂包括磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质、Na2CO3、Gibb酚试剂。根据本专利技术的方法，所述Gibb酚试剂的浓度为4-16g/L，优选8-12g/L。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括标准比色卡和显色试剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括标准比色卡和显色试剂。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色试剂包含酚酞磷酸钠或者磷酸苯二钠中的一种，例如选自包含酚酞磷酸钠或磷酸苯二钠的显色试剂。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述标准比色卡包含至少两个颜色深浅不同的色块，例如包含5-10个色块；
优选地，所述标准比色卡各个色块对应于不同的碱性磷酸酶标准活性浓度或生乳比例。
优选地，所述标准比色卡采用如下方法制作：采用不含ALP或ALP已完全失活的液态乳，加入不同活性浓度的ALP标准品或者不同比例的生乳，形成含有不同活性浓度的ALP或生乳比例标准品乳样，向该系列乳样中加入显色试剂，进行显色反应，得到不同浓度ALP或生乳比例显示的色彩，将其显示的色彩定为比色卡的标准色，标注对应颜色下的ALP活性浓度或生乳比例即得标准比色卡；
优选地，所述ALP标准品的浓度或加入生乳的比例以梯度递增；例如，所述梯度递增是以倍数递增。


4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述包含酚酞磷酸钠的显色试剂包括氨水、氯化铵、酚酞二磷酸四钠和水；
优选地，所述包含酚酞磷酸钠的显色试剂为所述酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液的酚酞磷酸钠溶液，其中所述NH3-NH4Cl缓冲溶液由所述氨水、氯化铵和水配制而成；
优选地，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂包括2,6-二溴苯醌氯亚胺、Na2CO3、磷酸苯二钠、乙醇、硼酸盐缓冲液和水；
优选地，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂中，由所述磷酸苯二钠、硼酸盐缓冲液配制磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质，所述2,6-二溴苯醌氯亚胺和乙醇配制成Gibb酚试剂，所述Na2CO3和水配制为Na2CO3溶液；
优选地，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂进一步包括正丁醇；
优选地，所述试剂盒包括至少一个棕色试剂瓶。


5.如权利要求1-4任一项所述试剂盒在乳品碱性磷酸酶活性检测中的应用，所述检测为半定量检测。


6.一种快速半定量检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤将显色试剂与待测样品接触，进行显色反应，将显色结果与指示ALP活性浓度或生乳比例的标准比色卡对比，确定样品中ALP活性浓度或生乳比例的范围。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述显色试剂为包括酚酞磷酸钠的显色试剂或者包括磷酸苯二钠的显色试剂；
优选地，所述包括酚酞磷酸钠的显...

【专利技术属性】
技术研发人员：王加启，郑楠，张养东，王峰恩，文芳，李松励，赵圣国，李慧颖，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11