荧光微球的染色方法技术

本发明专利技术涉及分析分离材料技术领域，特别涉及一种荧光微球的染色方法。所述的聚合物微球染色方法为：取０．０１－８０％的荧光素，０．１－８０％的聚合物微球，加入０－１０％的乳化剂、０－１０％的增粘剂，加入１８．９－９９．８９％的溶剂，溶剂可为良溶剂和不良溶剂中的一种或者多种的混合物，体系均匀分散后在１－１０１ｋＰａ下避光染色１－７２０ｈ，将染色后的聚合物微球取出，然后洗涤数次。本发明专利技术涉及的荧光微球具有制备工艺简单、荧光亮度高、荧光发射光谱范围宽、粒径分布均匀，相对标准偏差小，可应用于流式细胞仪的绝对计数微球、荧光免疫分析微球、生物传感器、微控流式芯片、荧光显微镜的校准品等分析分离领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析分离材料
，特别涉及一种。
技术介绍
流式细胞分析可应用于高通量分析，代谢过程分析，药物专利技术等许多领域，该方法具有高的灵敏度、选择性和便利性，可同时检测一个样品的多个参数，提供细胞多方面的信息。但是在流式细胞分析中，为精确计量细胞个数，需要一种绝对计数荧光微球作为检测的内参比物，要求计数微球粒度均匀，荧光强度均匀，荧光发射光谱范围较宽。目前国内市场没有国产荧光微球的产品，产品均为国外进口，流式细胞分析常用的荧光微球多数来自InterfacialDynamics Corporation(IDC)，Bangs Laboratories等公司，其他国外公司如BD、coulter等也代理荧光微球绝对计数产品，国内晶美公司主要代理Bangs Laboratories公司的产品，国内各级医院及各省市疾病控制中心所用试剂均为国外公司产品，这些国外试剂的价格非常高，主要是由于制备粒径和光强均匀的荧光微球技术比较繁琐、复杂，因此成本居高不下。国内专利CN1782020专利技术了包载碲化镉荧光量子点的二氧化硅荧光微球，专利CN1690163采用诱导相变法得到聚合物包载量子点荧光微球，但是由于粒径较小，难以用于流式细胞仪分析；专利CN1693411采用喷雾干燥方法制备了磁性荧光微球，但是实际操作中喷雾干燥法易使荧光素失活，专利CN1475805在合成的过程中同时掺入荧光素，制得了磁性荧光微球，但是荧光微球的亮度难以提高，美国专利从80年代以后，有多篇专利涉及荧光微球的合成以及配套试剂和仪器研究，如USP5073498、USP4157323、USP4336173、USP4714682、USP4774189涉及了荧光微球的合成方法和荧光素的使用原理，但是，由于流式细胞分析对荧光微球的均匀程度要求很高，而且为同时检测多个细胞群要求荧光微球的发射光谱范围较宽，因此怎样制备价格低廉、高亮度、粒径和光强均匀、宽荧光发射光谱范围的荧光微球，一直以来都是流式细胞分析领域的研究重点。荧光免疫分析、生物传感器、微控流式芯片、荧光显微镜的校准品对荧光微球的要求与流式细胞仪的要求相近，荧光免疫分析、生物传感器、微控流式芯片要求荧光微球能够特异性捕捉待检测的细胞、核酸、抗体或抗原，这就要求荧光微球表面带有一定的功能基团，能够捕捉待检测物质；而用于荧光显微镜的荧光微球校准品对荧光发射光谱的范围、荧光亮度和粒径的均匀性、被激发出荧光的色温，都有很高的要求，怎样制得价格低廉、高性能的荧光微球，一直都是分析分离领域的研究重点。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种工艺简单、荧光亮度高、荧光发射光谱范围宽、粒径和光强分布均匀的荧光微球，其可应用于流式细胞仪的绝对计数微球、荧光免疫分析微球、生物传感器、微控流式芯片、荧光显微镜的校准品等分析分离领域。本专利技术提供的本专利技术的一种，取0.01-80％的荧光素，0.1-80％的聚合物微球，加入0-10％的乳化剂、0-10％的增粘剂，再加入18.9-99.89％的溶剂，溶剂可为良溶剂和不良溶剂中的一种或者多种的混合物，体系均匀分散后在1-101kPa下避光染色1-720h，将染色后的聚合物微球取出，然后洗涤数次。所述的聚合物微球材料为聚丙烯酸酯类及其共聚物、聚苯乙烯类及其共聚物或硅胶透光性较好的聚合物材料；所述的荧光素为碱性藏花红、邻苯二酚紫、溴邻苯三酚红、吖啶类、菲啶类如溴化乙啶、碘化丙啶，罗丹明类核酸荧光素染料，四碘荧光素、香豆素类、异硫氰酸荧光素类、考马斯亮蓝蛋白荧光素染料，藻红/蓝蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、别藻蓝蛋白细胞染料，硫化镉类、硒化镉类或硫化锌无机类荧光素染料中的一种或多种。所述的聚合物微球包括含有荧光素或不含荧光素的聚合物微球，聚合物微球的粒径为0.1-20微米。含有荧光素微球需避光保存，保存温度为-20～4℃。所述的良溶剂包括卤代烷烃、烷烃、酯类、酮类和呋喃类聚合物良溶剂中一种或多种；所述的不良溶剂包括醚类、醇类、砜、酰胺类和水聚合物不良溶剂中一种或多种。所述的溶剂是三氯甲烷、二氯甲烷、四氯化碳、二溴代乙烷，如甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、正庚烷、环己烷、苯，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮，四氢呋喃、乙醚、甲醚、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、二甲基亚砜、N、N-二甲基甲酰胺和水。所述的乳化剂包括软脂酸钠、硬脂酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、N-十二烷基二甲胺、F-68、对辛基苯酚聚氧乙烯醚、山梨醇脂肪酸酯、吐温型乳化剂、辛基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯醚、聚氧丙烯醚或牛血清蛋白中的一种或者多种。所述的增粘剂包括明胶、木质素磺酸钠、氧羧甲基壳聚糖、羟甲(乙)基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、甘油、海藻酸钠或聚乙二醇中的一种或者多种。制备的聚合物荧光微球，粒径和荧光强度均匀，相对标准偏差小，各种不同亮度的荧光微球均可获得，在流式细胞仪上分析时，前向角散射光数值、侧向角散射光数值和亮度数值分布很窄，不与细胞分布区域重叠；荧光发射光谱范围宽，在同一激发光源下，绿色荧光(FL-1)、黄色荧光(FL-2)和红色荧光(FL-3)均可获得，覆盖大多数细胞染色剂的荧光光谱范围，满足了流式细胞仪对荧光微球发射光谱的要求。聚合物微球可以采用通常使用的方法，如加工成型方法，是先将聚合物材料用溶剂溶解，可同时将荧光素溶解在溶剂中加入；然后在搅拌分散如机械搅拌、磁搅拌条件下，将油相逐渐加入到水相中，或者通过膜如SPG膜、微滤膜，将油相分散在水相中，避光在空气中挥发1-24h，将聚合物微球取出然后洗涤数次；所述水相包含通常的乳化剂、增粘剂、pH值调节剂、低分子醇类、无机盐、蔗糖中的一种或者多种。总之，与现有的材料相比，本专利技术涉及的荧光微球具有制备工艺简单、荧光亮度高、荧光发射光谱范围宽、粒径分布均匀，相对标准偏差小，可应用于流式细胞仪的绝对计数微球、荧光免疫分析微球、生物传感器、微控流式芯片、荧光显微镜的校准品等分析分离领域。附图说明图1荧光微球在无激发光时的照片；图2荧光微球在λE＝450～480nm，滤光片＞515nm时的照片，发黄绿色荧光；图3荧光微球在λE＝515～545nm，滤光片＞590nm时的照片，发红色荧光；图4荧光微球在λE＝350～380nm，滤光片＞420nm时的照片，发黄色荧光。颜色和荧光素的种类有关，使用不同激发光和滤光片，并非所以荧光素都能够激发，而本专利的产品适用范围很宽。λE表示激发波长。具体实施方法下面给出本专利技术的实施例，是对本专利技术的进一步说明，而不是限制本专利技术的范围。实施例1取0.001g异硫氰酸荧光素，0.01g粒径为5微米、相对标准偏差小于2％的交联聚苯乙烯微球(市面有售，如天津市倍思乐色谱技术开发中心)，向荧光素和微球中加入0.1g二甲基亚砜浸润荧光素和聚苯乙烯微球后，再加入9.889g三氯甲烷，混合均匀后在1kPa下避光染色12h，将染色后的聚苯乙烯微球取出，然后洗涤数次。所得微球的荧光光强相对标准偏差为4％，在流式细胞仪上分析亮度在2000-2200之间，荧光发射光谱范围在500-530nm之间。实施例2取8g吖啶橙，0.01g粒径为5微米、相对标准偏差小于10％的硅胶微球，向荧光素和微球中加入0.1g N、N-二甲基甲酰胺浸润荧光素和硅胶微球本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光微球的染色方法，其特征是：取０．０１－８０％的荧光素，０．１－８０％的聚合物微球，加入０－１０％的乳化剂、０－１０％的增粘剂，再加入１８．９－９９．８９％的溶剂，溶剂为良溶剂和不良溶剂中的一种或者多种的混合物，体系均匀分散后在１－１０１ｋＰａ下避光染色１－７２０ｈ，将染色后的聚合物微球取出，然后洗涤数次。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：常津，张琦，王伟财，韩艳，王鹏飞，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]