作为多肽支架的血红素结合蛋白样结构制造技术

本发明专利技术涉及用于产生对预定靶分子具有特异结合特性的多肽的方法，其中所述特异结合特性不天然为此多肽固有。同时本发明专利技术描述了结合特异性的优化以及产生的方法。本发明专利技术还涉及用于在多肽支架中鉴定和修饰特定氨基酸位置的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为多肽支架的血红素结合蛋白样结构本专利技术涉及用于制备对预定靶分子具有特异结合特性的多肽的方法， 其中所述特异结合特性不天然为此多肽固有。同时本专利技术描述了优化结合 特异性的方法以及产生的方法。本专利技术还涉及用于在多肽支架中鉴定和修 饰可改变的M酸位置的方法。
技术介绍
近年来，与亲和试剂相关的专利申请和公开的数量稳定增加。它们中 的大多数涉及抗体，即单克隆或多克隆的免疫球蛋白。仅有一小部分涉及 可能的备选方案。这些备选方案之一是蛋白质支架的使用。此概念需要在一级结构水平耐受多个替换或插入的稳定蛋白质架构(Nygren, P-A., Skerra， A.， J. Immun. Meth. 2卯(2004)3-28)。域。众多其它问题中唯一问M抗体在细胞内的应用.这种蛋白质敲除技 术的瓶颈在于并非细胞内表达的所有抗体均性能良好。这被称作"二硫键问 题"。为了解决该问题，不得不开展费时的实验以优化一系列复杂参数 (Visintin， M.等，J. Imnmn. Meth. 290(2004)135-153),就此而言，蛋白质具有数种优势。在这些优势中包括低分子量，易于 由微生物产生、修饰筒单以及应用广泛。已经在本上下文中描述了不同的 蛋白质支架，例如用于DNA识别的锌指蛋白(Segal， D丄等，Biochem. 42(2003)2137-2148);通过在活性中心环内导入可变多肽序列加以修饰的基 于疏氧还蛋白的肽适体(Klevenz， B.等，Cell. MoL Life ScL 59(2002)1993-1998);作为"亲和体(affibody )，，支架的蛋白A(Sandstrom， K. 等，Prot. Eng. 16(2003)691-697; Andersson， M.等，J. Immun. Meth.283(2003)225-234);第十纤连蛋白III型结构域的mRNA-蛋白质分子(Xu， L 等，Chem. Biol. 9(2002)933-942)或基于a-淀粉酶抑制剂的结合分子 (McConndl， S丄和Hoess， R.H.， J. Mol. Biol. 250(1995)460-470)。两个标准基本上描述了可应用蛋白质支架的特征首先，蛋白质应当 属于显示已充分定义的疏水核心的家族。各个家族成员间的密切关系是有 益的(Skerra, A., J.MoI. Recognit. 13(2000)167-187)。其次，蛋白质应当具 有空间上分隔且功能独立的可接近的活性中心或结合袋。活性中心或结合 袋不应当对核心的内在稳定性有贡献(Predki， P.F.等，Nature Struct. Biol. 3(1996)54-58)。理想地，这种蛋白质家族本身参与识别非相关的多个耙标。如Nygren， P画A.和Skerra， A.， J. Immun. Meth. 290(2004)3-28中所述， 已经采用数种多肽支架用于开发新的亲和蛋白质。这些支架可以分为三类 (i)单肽环、(ii)工程化的界面和(iii)非连续的超变环。对于第一类支架，使在暴露的环内的单个氨基酸多样化或者将小的多 肽序列插入这个暴露的环内(见例如Roberts, B丄.等，PNAS 89(1992)2429-2433和Gene 121(1992)9-16; Rottgen， P.和Collins, J.， Gene 164(1995)243; Lu， Z.等，Bio/Technology 13(1995)366-372)。这种方法的一 个缺点是难以实现对全新靶标的亲和性，即便有也很低(Klevenz， B.等， Cell. Mol. Life Sci.59(2002)1993-1998),可以修饰对天然的或密切相关的把 标的内在结合亲和性，但是几乎难以改变靶标或乾标族。另一个缺点是在 插入小的随机化多肽时，靶标必须已知并且这些序列必须基于已经得到的 知识事先产生。第二类支架属于例如葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白结合结构域(例如 SandstHim, K.等，Prot. Eng. 16(2003)691-697)、真菌里氏木霉(7: i^ew/) 纤维二糖水解酶I的羧基端纤维素结合结构域(Smith， G.P.等，J. Mol. Biol. 277(1998)317画322)和7曙晶态(Fiedler， U.和Rudolph, R., WO 01/04144).第三类支架以免疫球蛋白自身和远射目关的纤连蛋白ni型结构域以 及某些类型的神经毒素为代表。除了作为用于产生对预定靶分子的特异结合特性的支架适合性(suitability)之外，还必须考虑应用条件。其中尤其应考虑亲和多肽的稳 定性、选择性、溶解性和功能性产生。例如，已经如上提及，蛋白质敲除 技术的瓶颈在于并非细胞内表达作为亲和分子的全部抗体均功能性地产生 ("二硫键问题，，，Visintin， M.等，J. Immun. Meth. 2卯(2004)135-153)。因此，本专利技术的目的是通过提供对预定靶分子具有特异结合特性的备 选多肽支架而克月艮这些缺点，其中所述特异结合特性不天然为多肽固有。 这包含氨基酸的随机化、优化结合特性以及产生具有特异结合特性的优化 多肽的方法。专利技术概述本专利技术提供了特异性结合预定靶分子的多肽，其特征是多肽的氨基酸 序列选自SEQ ID NO:02至SEQ ID NO:61，其中在所述^J^酸序列中改 变根据表V的至少一个氨基酸。本专利技术还包含用于在原核微生物或真核微生物中产生特异性结合预定 靶分子的多肽的方法，其特征是所述微生物含有编码所述多肽的基因并且 该多肽得到表达。靶分子的多:的栽体。、 ，； '多肽可以通过本领域技术人员已知的方法加以分离和纯化。 在本专利技术的另一个实施方案中，预定靶分子是刺猬蛋白(hedgehogproteins)、骨形态发生蛋白、生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白细胞介素和干扰素中的一个成员。本专利技术还提供用于从DNA文库中鉴定编码特异性结合预定靶分子的多肽的核酸的方法，其中该方法包括步骤a) 从SEQ ID NO:02至SEQID NO:61中选#^序列；b) 制备其中至少一个根据表V的M酸位置得到改变的所i^列的 DNA文库；c) 对制备的DNA文库筛选所编码的特异性结合预定把分子的多肽；d) 选择编码一种在步骤c)中经鉴定的特异性结合物的核酸；e) 重复步骤b)至d)二到五次；以及f) 分离编码特异性结合预定靶分子的多肽的所述核酸。 在另一实施方案中，用于从DNA文库中鉴定编码特异性结合耙分子的多肽的核酸的方法包括线性表达元件。在另一实施方案中，多肽文库通过在核糖体上展示表达。 在另一实施方案中，多肽文库通it^噬菌体上展示而表达。 本专利技术还包括用于在多肽中确定可改变的M酸位置的方法，包括步激a) 收集来自相同和/或不同生物的在结构和/或功能上同源的多肽的多 个序列；并且b) 根据共有结构和/或共有序列和/或功能性基序比对序列，和c) 在比对中通过计数在序列每一位置处发现的不同氨基酸的数确定 所有M酸位置的可变性；以及d) 将可改变的M酸位置确定为具有总数为8个或更多个不同M 酸的M酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性结合预定靶分子的多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列选自ＳＥＱＩＤＮＯ：０２至ＳＥＱＩＤＮＯ：６１，其中在所述氨基酸序列中至少一个根据表Ｖ的氨基酸被改变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M兰岑多费尔，M施拉伊姆尔，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]