来自血浆的低聚糖的分析方法技术

本发明专利技术涉及血浆低聚糖的分析方法，这些低聚糖构成低分子量肝素和非常低分子量肝素。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的目的是，这些低聚糖构成 低分子量肝素和非常低分子量肝素。这些肝素是糖胺聚糖族的生物活性剂，它们具有特别有用的抗凝 血性。将肝素多糖长链切成低分子量短链，制备出这些低分子量肝素(HBPM)和非常低分子量肝素(HTBPM)。构成HBPM和HTBPM的低聚糖通常用宏观参数(例如它们的平均 分子量)或生物活性(例如aXa活性(IU/mg))进行表征。测量与抗凝血酶 III相互作用的方法是最常使用的方法。然而，测量这些宏观参数与生物活性并不能回答几个至关重要的 问题。特别地，不可能基于这些标准分析构成HBPM和HTBPM的不 同低聚糖的药物代谢动力学分布图。例如，aXa活性仅考虑了对ATIII 有亲和力的种类，即仅约20%混合物；因此，80%低聚糖的性能没有 测定。此外，构成亲和性混合物的每个种类的份额不可能测量到。因此，不可能精确地确定每种低聚糖的血浆浓度，更有理由地， 通过简单测定其aXa活性不可能精确地确定其药物代谢动力学分布 图。然而，这些分布图为改进HBPM和HTBPM基药品剂量提供了非 常有价值的信息。为了能够分析血浆中构成HBPM或HTBPM的不同低聚糖的性 能，应该能够完全而再现地将血浆中的这些低聚糖与其它組分(特别是 蛋白)分离。现在技术描述的方法利用强蛋白酶处理(Volpi等人，1995, 《Biochim. Biophys. Acta.》，1243(1)， 49-58)。色谱法或电泳法有可能分析HBPM的不同组分。例如，采用毛细 管电泳法(EC)分离肝素低聚糖(Guerrini等人，《糖生物学》 (Glycobiology)， 2002， 12， 713-719; Linhardt等人，《BioMethods》， 1997， 2， 183-197)。然而，EC的选择性比液相色镨法低得多。在某些 情况下，还可能使用MALDI-TOF质谱分析法分析肝素低聚糖，但这 种方法不能应用于复杂的混合物，更不用说它的高成本。因此，特别地采用高效液相色谱法(CLHP)分析硫酸化低聚糖，如 构成HBPM和HTBPM的硫酸化低聚糖。最近(WO 2004/027087)描述了一种HBPM分析方法，该方法包括酶解聚作用，接着如果必要进行 还原反应，与CLHP定量分析。最近欧洲申请(EP 042卯789.9)公开了 采用阴离子交换色谱法定量测定构成HBPM和HTBPM的低聚糖的方 法。该方法利用反相硅胶柱动力学吸附季铵盐，特别地鲸蜡基甲基铵 的阴离子交换色谱法，它们在pH 2-12范围内保持净正电荷并且不变。 在使用CTA-SAX柱进行HBPM和HTBPM的CLHP分析之前，这种 方法可能涉及预处理，解聚或采用排阻色谱法的分离。本专利技术的目的是血浆低聚糖的分析方法，其特征在于进行下述两 个步骤誦处理血浆样品，-CLHP的定量分析。在采用CLHP定量分析前，该方法既不涉及对血浆样品中的低聚 糖进行酶解聚，也不涉及采用排阻色谱法进行分离。另一方面，根据 这种方法，采用过滤方法处理这种血浆样品，以便分离这些低聚糖， 让它们在滤液中与血浆污染物，特别是留在浓缩物中的蛋白质再接因此，本专利技术的目的更特别地是如前面所定义的方法，其中采用 过滤方法处理这种血浆样品。本专利技术的一个非常特别的目的是如前面 所定义的方法，其特征在于分子量大于30kDa的分子留在该浓缩物中。为了能够对血浆样品处理方法进行量化，并验证这种处理在样品 间的再现性，如果必要往样品中添加内标。这个内标应该是一种低聚 糖，如果可能的话在结构上接近定量产物，该产物在过滤前才与血浆 混合。本专利技术的另一个目的因此是如前面所定义的方法，其特征在于在 过滤前才往血浆样品中添加对照低聚糖。尽管采用过滤方法将大多数低聚糖与蛋白质分离，但可能的是一 部分依然因与浓缩物的静电相互作用而被捕获。在这种情况下，必须 使用盐溶液对浓缩物进行一次或多次洗涤。本专利技术的另一个目的因此是如前面所定义的方法，其特征在于该 浓缩物使用盐溶液进行至少一次洗涤。根据本专利技术，该盐溶液优选地是氯化钾溶液。更特别地，本专利技术的目的是如前面所定义的方法，其特征在于盐溶液在添加到浓缩物之后的浓度大于或等于1M，非常特别地，是这样 一种方法，其中盐浓度大于或等于2M。用盐溶液洗涤一次或多次后，如果必要，该浓缩物再用水洗涤。 因此本专利技术的目的是如前面所定义的方法，该方法包括该浓缩物在用 盐溶液洗涤至少一次之后再用水洗涤的步骤。原始滤液与来自洗涤操作的滤液合并，该合并滤液用水稀释5倍。 这种稀释使所有的低聚糖在注入色谙柱后能够再浓缩，同时防止由于 盐浓度过高造成峰加宽。注射后立即添加1NHC1将溶液的pH调节到 3。根据本专利技术方法，直接注入全部的滤液，如果必要，还有全部洗 液，并进行CLHP分析。阴离子交换CLHP是最适合于这样一种复杂混合物的分离方法。 特别地，CLHP使用通过共价键接枝季铵的阴离子交换柱。这类色谱 柱的优点是能够使用高氯酸盐作为流动相，而使用CTA-SAX色谱柱则 是不可能的，因为高氯酸盐与CTA有强络合作用。因此，本专利技术的另一目的是如前面所定义的方法，其中采用阴离 子交换CLHP定量测定低聚糖。更特别地，本专利技术的目的是如前面所 定义的方法，其中采用CLHP，使用通过共价键接枝季铵的阴离子交换柱定量测定低聚糖.可以使用粒度9-13pm、长度25cm的IonPAc AS11型(Dionex)柱。 可以使用直径l-4.6mm的所有常用色谱柱，但优选使用直径2mm的色 谱柱。在更一般的范围内，可以使用更小直径(例如lmm)的柱，实际 上需要更少量的血浆，还能够提高分析灵敏度.使用的装置可以是能形成洗脱梯度，使用UV检测器的色谱仪。应 优选使用装有二极管阵列的检测器，它能够获得这些成分的UV光谱， 记录由两个不同波长的吸光度(absorbance)之差造成的复杂信号，该复 杂信号使得检测血浆源化合物中的乙酰化低聚糖成为可能。使用直到 200nm都透明的移动相能够有利于区分这些成分。这里使用的移动相 优选地应是高氯酸钠溶液，不过也可以使用甲磺酸盐或磷酸盐。因此，本专利技术的目的是如前面所定义的方法，其特征在于使用直 到200nm都透明的移动相。特别地，本专利技术的目的是如前面所定义的方法，其特征在于移动相是高氯酸钠溶液、甲磺酸盐溶液或磷酸盐溶 液。非常特别地，本专利技术的的目的是如前面所定义的方法，其特征在 于移动相是高氯酸钠溶液。这种分离所推荐的pH是2-6.5。优选地使用pH约3。添加盐(如磷 酸盐)可以达到该pH，磷酸盐在pH-3的緩冲能力比高氯酸盐的好。 作为实例，下面给出色语分离的标准条件 -溶剂a: 2.5mmNaH2P04，添加H:jP04将pH调节到2.9， -溶剂B: lNNaC104， 2.5mmNaH2P04，添加H3P04将pH调节 到3.0，洗脱梯度可以如下T=0min: %B=3; T=40min: %B=60; T=60min: o/oB=80 对于直径2mm的色镨柱，选择的流量例如是0.22ml/min，柱温度 401C。采用uv检测在过滤血浆样品中的低聚糖。由于所有非乙酰化多糖 在一定的pH下都具有几乎相同的UV谘，所以以两个选择波长的吸光 度(absorban本文档来自技高网...

【技术保护点】
来自血浆的低聚糖的分析方法，其特征在于进行下述两个步骤：　　　　ａ、处理样品，然后　　　　ｂ、采用高效液相色谱法（ＣＬＨＰ）的定量测定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P莫里尔，C维斯科夫，
申请(专利权)人：艾文蒂斯药品公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]