一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法和应用。本发明专利技术通过将鸡源TRIM25基因扩增产物连入pMD18‑T载体，获得pMD18‑T‑ChTRIM25；然后用BamH I和EcoRI分别酶切pEGFPC1载体和pMD18‑T‑ChTRIM25，回收载体pEGFPC1和含有启动子的ChTRIM25片段，并用T4‑ligase连接，提取重组质粒，酶切鉴定，构建得到鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒。利用本发明专利技术构建的重组荧光表达质粒可以开展鸡TRIM25功能的研究，以及抗RNA病毒转基因鸡的制备。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法和应用
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法和应用。
技术介绍
TRIM蛋白家族第一个成员，非洲爪蟾核因子7于1991年被克隆鉴定以来，在人类的基因组中已经发现了近80个TRIM家族蛋白。TRIM家族蛋白由于其具有的特殊RBCC(RING/B-box/coiled-coil)结构，又被称为锌指蛋白。从N端到C端，首先是RING结构域、中部为一个或者两个B-box结构域，以及C端一个coil-coiled结构域。TRIM家族的成员在细胞分化、增殖、发育、凋亡等众多的生物学过程中发挥重要的生理作用，尤其在天然免疫的一系列生物过程，对逆转录病毒具有限制作用。TRIM25蛋白是从属于C-Ⅳ亚家族中的TRIM蛋白家族之一，该蛋白N端具有TRIM蛋白家族典型的RING，B-box，Coiled-coil(RBBC)结构域，C端还有一个PRY/SPRY结构域。其主要在女性生殖器官(子宫，卵巢和乳腺)以及乳腺癌和卵巢癌中表达；另外，发现其再免疫相关信号通路和抗病毒免疫反应中也发挥着重要的作用，例如，TRIM25蛋白可通过参与机体的先天性抗RNA病毒反应，抑制人艾滋病毒，鼠白血病病毒，禽白血病病毒和B型乙肝病毒等RNA病毒在细胞内的复制。2015年首次报道了鸡TRIM25全基因，克隆了鸡TRIM25的全长cDNA，荧光定量检测发现TRIM25蛋白在鸡的免疫组织如胸腺、法氏囊和肺脏等含量较高。比较发现鸡TRIM25蛋白与人和小鼠的TRIM25同源性分别仅为在47.6％和45.7％(Fengetal.,2015)。此外，还分析了在体内外感染新城疫病毒(NDV)后，以及经Poly(I:C)或Poly(dA:dT)刺激的鸡胚成纤维细胞(CEF)中TRIM25蛋白表达水平的改变。因鸡免疫器官的特殊性，对鸡TRIM25功能和作用机制知之甚少，许多亟待进一步深入研究。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒。利用该重组荧光表达质粒可以开展鸡TRIM25功能的研究，以及抗RNA病毒转基因鸡的制备。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法，包括以下步骤：(1)提取鸡脾组织细胞中的RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，利用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物进行PCR扩增，得到大小为1881bp鸡源TRIM25基因扩增产物；(2)将步骤(1)得到的鸡源TRIM25基因扩增产物连入pMD18-T载体，获得pMD18-T-ChTRIM25；然后用BamHI和EcoRI分别酶切pEGFPC1载体和pMD18-T-ChTRIM25，回收载体pEGFPC1和含有启动子的ChTRIM25片段，并用T4-ligase连接，提取重组质粒，酶切鉴定，构建得到大小约为6500bp鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒。优选的，步骤(1)中，PCR扩增的体系为25μL，包括：cDNA模板2μL，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物各1.0μL，2×EsTaqMasterMix12.5μL，ddH2O8.5μL。优选的，步骤(1)中，PCR扩增的条件为：94℃4min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min50s，循环37次；72℃，6min。优选的，步骤(3)中，T4-ligase连接的温度为23℃，连接时间为2h。本专利技术的第二方面，提供上述方法构建的鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒。本专利技术的第三方面，提供上述鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒在鸡TRIM25过表达研究中的应用。本专利技术的第四方面，提供上述鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒在制备抗RNA病毒转基因鸡中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术构建了一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒，可以用于开展鸡TRIM25功能及应用的研究，也可以用于抗RNA病毒转基因鸡的制备。附图说明图1：本专利技术的鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒(ChTRIM25-GFP)的构建及鉴定；其中，A：鸡TRIM25开放阅读框目的基因的扩增(泳道M1，DNAmarker；泳道1和2，鸡TRIM25目的基因，1881bp)；B：含鸡TRIM25基因的重组克隆载体的酶切鉴定(泳道M1和M2，均为DNAmarker；泳道3和4，克隆载体TRIM25-T双酶切)；C：含鸡TRIM25和GFP基因的重组过表达质粒(泳道M3，DNAmarker；泳道5，TRIM25-GFP；泳道6，TRIM25-GFP单酶切)；D：TRIM25-GFP质粒转染DF1细胞后胞内绿色荧光信号；E：TRIM25-GFP质粒转染DF1细胞后TRIM25mRNA转录水平的变化(**，组间差异极显著P<0.01)；F：TRIM25-GFP质粒转染DF1细胞后胞内TRIM25蛋白水平表达变化。图2：DF1细胞鸡TRIM25过表达对ALV-A病毒复制的抑制作用；其中，dpi，鸡TRIM25过表达质粒接种后的天数；DF1细胞上清中ALV-A/K病毒滴度是使用IDEXXALVP27抗原ELISA试剂盒检测计算所得；(**,P<0.01)。图3：DF1细胞鸡TRIM25过表达对ALV-K病毒复制的抑制作用；其中，dpi，鸡TRIM25过表达质粒接种后的天数；DF1细胞上清中ALV-A/K病毒滴度是使用IDEXXALVP27抗原ELISA试剂盒检测计算所得；(**,P<0.01)。图4：活体成像系统观测出壳后雏鸡各组织中GFP荧光信号图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
部分介绍的，由于鸡TRIM25蛋白与人和小鼠的TRIM25同源性分别仅为在47.6％和45.7％，加之鸡免疫器官的特殊性，目前对鸡TRIM25功能和作用机制知之甚少，许多亟待进一步深入研究。绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因无需底物、诱导物等的参与，无毒害、无损伤，在异源细胞内自主表达、自发产生荧光，能简单、灵敏的动态检测，克服了传统报告基因成本高、操作繁琐，不能反映体内真实过程的缺点，是较为理想的报告基因。因此，构建鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒非常有利于鸡TRIM25功能和作用机制的研究。但目前还没有用鸡TRIM25基因构建重组荧光表达载体。以往都是用人或其它哺乳动物TRIM25基因构建的，获得TRIM25蛋白与本专利技术表达的鸡TRIM25蛋白结构组成上差异性较大(同源性少于60％)。基于此，本专利技术设计构建了一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒，以用于鸡TRIM25功能和作用机制的研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)提取鸡组织细胞中的RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，利用SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的引物进行PCR扩增，得到大小为1881bp的鸡源TRIM25基因扩增产物；/n(2)将步骤(1)得到的鸡源TRIM25基因扩增产物连入pMD18-T载体，获得pMD18-T-ChTRIM25；然后用BamH I和EcoRI分别酶切pEGFPC1载体和pMD18-T-ChTRIM25，回收载体pEGFPC1和含有启动子的ChTRIM25片段，并用T4-ligase连接，提取重组质粒，酶切鉴定，构建得到的鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取鸡组织细胞中的RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，利用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物进行PCR扩增，得到大小为1881bp的鸡源TRIM25基因扩增产物；
(2)将步骤(1)得到的鸡源TRIM25基因扩增产物连入pMD18-T载体，获得pMD18-T-ChTRIM25；然后用BamHI和EcoRI分别酶切pEGFPC1载体和pMD18-T-ChTRIM2...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧君，李宏梅，周金润，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37