一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的扩增组合物制造技术

本发明专利技术公开一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的扩增组合物，体外稳定扩增NK细胞方法包括以下步骤：(1)分离单个核细胞；(2)免疫分选去除CD3

【技术实现步骤摘要】
一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的扩增组合物
：本专利技术涉及到免疫细胞治疗领域，具体是一种自体或同种异体外周血单个核细胞在体外稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞的方法，具体涉及茶叶活性成分在体外稳定扩增高活性NK细胞的方法及其应用，更具体涉及茶叶中的咖啡碱和茶多酚在体外稳定扩增高活性NK细胞的应用。
技术介绍
：茶叶为山茶科植物茶的芽叶，早在唐代陈藏器《本草拾遗》中就有记载：诸药为各药之药，茶为万药之药。现有研究茶叶中的化学成分经分离鉴定的已知化合物有500多种，其中有机化合物有450种以上，构成这些化合物的基本元素有30种，茶叶中不仅含有丰富的维生素和矿物质，而且含有许多对人体有保健作用的功效成分如：茶蛋白、茶多酚、茶多糖、咖啡碱、茶叶皂苷、γ-氨基丁酸、茶氨酸、茶色素等。随着对茶叶成分、药理作用研究的深入，发现茶叶具有广泛的治疗保健作用，如：具有降血糖、降血脂、降血压、抗血栓、增强机体免疫力、抗氧化、抗菌和抗辐射等生理功能，作为保健食品和药品具有广阔的开发前景。细胞免疫治疗是目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤。目前，NK细胞免疫治疗受到越来越多的重视。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为CD3-CD56+，NK细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的CD56highCD16-细胞和具有细胞毒活性的CD56dimCD16+细胞。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。NK细胞在机体免疫系统抵抗肿瘤的反应中发挥必不可少的作用，机体NK细胞功能紊乱，是肿瘤发生、发展的可能原因之一。自体或者同种异体NK细胞已经用于治疗恶性淋巴瘤、难治性非霍奇金淋巴瘤、复发性/难治性急性白血病、急性髓性白血病、儿童复发/难治性神经母细胞瘤、晚期胃癌、结直肠癌、结直肠癌/胰腺癌肝转移以及多种复发性、转移性实体瘤。临床显示出良好的耐受性和一定的治疗效果。NK细胞的治疗效果和回输的NK细胞的纯度和数量呈正相关。目前已经有一些可提供临床使用的NK细胞扩增技术，但是多采用饲养细胞(例如，表达IL-15和41BB配体的K562细胞、EBV转化的类淋巴母细胞细胞系、Wilm’s肿瘤细胞、射线辐照的PBMCs等)进行刺激外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)或者纯化富集后的NK细胞获得大量功能完备的NK细胞。现有的NK细胞扩增方法要么NK细胞的扩增数量较低，难以满足临床应用需求；要么采用饲养细胞的培养方法，临床应用存在一定的风险，而且NK细胞扩增培养步骤繁琐，成本较高，NK细胞比例相对较低，有残留的T细胞和B细胞，具有引起GVHD的风险。目前一些专利文献报道的无饲养细胞的NK细胞扩增方法，多采用anti-CD3抗体和anti-CD16抗体包被细胞培养瓶刺激、活化NK细胞，细胞培养方法繁琐、不稳定、扩增的NK细胞纯度较低。因此，急需开发一种稳定的、无血清、无饲养细胞的NK细胞扩增培养体系。
技术实现思路
：因现有技术存在的不足，解决现有NK细胞培养技术繁琐、NK细胞纯度低、杀伤功能弱、培养体系不稳定的缺点，本专利技术提供一种无血清、无饲养细胞的NK细胞体外扩增方法，可在体外培养条件下稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞，从而能够有效的提供满足临床应用所需的NK细胞。同时开展茶叶有效成分的功能性研究，发现茶叶中的咖啡碱和茶多酚在体外共同作用促进NK细胞生长，可大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞。为了达到上述目的，本专利技术设计了一种无血清、无饲养细胞的NK细胞体外扩增方法，扩增方法由以下步骤构成：(1)分离单个核细胞；(2)通过免疫分选去除单个核细胞中的CD3+T淋巴细胞；(3)加入NK细胞培养用无血清细胞培养基及终浓度为10-500ng/ml咖啡碱、10-500ng/ml茶多酚、和500-2000U/mlIL-2细胞生长扩增组合物接种在细胞培养瓶体外培养2-5天后全换液；(4)NK细胞换液；(5)收获NK细胞。本专利技术所述单个核细胞是通过肝素抗凝无菌一次性采血管静脉穿刺采集外周血后，通过Ficoll密度梯度离心获得或者通过单采机采集的单个核细胞；或者来自于脐带血、骨髓和iPSCs诱导分化得到的单个核细胞。所述免疫分选去除单个核细胞中的CD3+T淋巴细胞可采用免疫磁珠、膜泡免疫分选和流式细胞仪免疫分选等方法。所述去除CD3+T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-3.5×106cells/ml，优选为1.5×106cells/ml。所述细胞生长扩增组合物中所用咖啡碱的浓度优选为10-500ng/ml，优选120-350ng/ml。所述细胞生长扩增组合物中所用茶多酚的浓度优选为10-500ng/ml，优选100-300ng/ml。所述细胞生长扩增组合物中所用白介素-2的浓度优选为500-2000U/ml，优选1000-1600U/ml。其中上述的茶叶的茶多酚为表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、表儿茶素没食子酸酯ECG、表没食子儿茶精EGC、表儿茶素EC。其中更优选为表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、表儿茶素没食子酸酯ECG。所述NK细胞全换液天数优选为第4天，细胞浓度优选为1×106cells/ml。所述NK细胞换液为通过补加含NK细胞扩增所需细胞扩增组合物的NK细胞无血清培养调整NK细胞浓度至1×106cells/ml。所述NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的有益效果：与现有NK细胞扩增方法相比，所述NK细胞扩增方法无需血清、无需饲养细胞刺激、无需预先包被培养瓶，减少现有技术中使用各种细胞因子，降低成本，通过使用茶叶中的咖啡碱和茶多酚等即可建立稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞，简单可行。同时开发茶叶中有效成分的咖啡碱和茶多酚的用途和使用价值。附图说明：图1为扩增培养NK细胞生长曲线。图2为扩增培养NK细胞在第6天、第16天和第21天的扩增倍数。具体实施方式：下面结合具体的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1NK细胞体外扩增-单核细胞的分离1.单核细胞的分离1.1在生物安全柜正常工作状态下，50ml无菌离心管分别加入F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的扩增组合物，包括以下步骤：/n(1)分离单个核细胞；/n(2)免疫去除CD3

【技术特征摘要】
1.一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的扩增组合物，包括以下步骤：
(1)分离单个核细胞；
(2)免疫去除CD3+T淋巴细胞，去除CD3+T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-2×106cells/ml；
(3)加入无血清培养基和扩增组合物；
(4)培养第2-5天全换液；
(5)NK细胞收获；
其特征在于：步骤3中加入的扩增组合物为：咖啡碱、茶多酚、和IL-2。


2.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的扩增组合物，其特征在于：步骤3中加入的扩增组合物终浓度为10-500ng/ml咖啡碱、10-500ng/ml茶多酚、和500-2000U/mlIL-2。


3.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的扩增组合物，其特征在于：免疫去除CD3+T淋巴细胞的方法为免疫磁珠分选、膜泡分选和流式细胞仪分选等；去除CD3+T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-2×106cells/ml。


4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖君清，陈婉珍，
申请(专利权)人：泉州台商投资区忆品茶业有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35