乙酰胆碱酯酶的提取方法及应用技术

乙酰胆碱酯酶的提取方法及应用，涉及一种提取鲫鱼乙酰胆碱酯酶的方法及用其检测有机磷农药残留量的方法。提取法如下：鲫鱼的组织用磷酸缓冲溶液在冰浴条件下匀浆，冷冻离心，得酶液。检测方法是以鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶为酶源，以２，６－二氯靛酚钠为显色剂，以定性滤纸为载体，以吸附法固定化酶。具体操作为：取过塑硬纸片，粘上小滤纸片，一边加显色剂和碘化硫代乙酰胆碱溶液，另一边加乙酰胆碱酯酶溶液，滤纸片放入冰箱中冷藏干燥，用时取出，有机磷农药洗脱液滴加至滤纸上，滤纸充分润湿，两片滤纸片叠合几分钟后观察变色，无有机磷农药存在时试纸由蓝色变为无色，反之蓝色不褪或褪色不明显，浓度越高越明显。本发明专利技术成本低、检测速度快、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从鲫鱼的脑、肌肉及肝脏中提取乙酰胆碱酯酶的方法及用其快速 检测有机磷农药残留量的方法。
技术介绍
现有《一种从动物血液中提取乙酰胆碱酯酶的制备方法》(专利申请号02134464), 包括以下工艺步骤将大白鼠、鸡、鸭、牛、狗、兔、黄鳝鱼、鳗鱼的血液于室温下 凝固，冷冻，取其上清液，上清液离心分离，得乙酰胆碱酯酶粗提液，用硫酸铵沉淀 法纯化，用透析法脱硫酸铵，酶液浓縮干燥，得纯化的乙酰胆碱酯酶制品。有用乙酰胆碱酯酶检测农药残留量，如《一种重组乙酰胆碱酯酶及其制备方法和 检测方法》(专利申请号200610028885)，用于农产品中农药残留的检测，用二硫双对 硝基苯甲酸(DTNB)作显色剂，硫代丁酰胺胆碱为底物，通过比色，最后计算抑制率 (%)。还有《一种常规农药快速残留检测方法》(专利申请号02148533)，以小白鼠肝 脏乙酰胆碱酯酶作为酶源，以乙酰代胆碱为底物，底物在乙酰代胆碱酯酶的作用下， 水解生成硫代胆碱与二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)，起显色反应，通过固定酶作用比 较不同浓度杀虫剂作用的OD 值，制定标准曲线，将待测样品经过浸渍萃取 后测得OD 值，根据待测样品的OD 值，判定待测物中农药残留浓度 及抑制率。还有以乙酰胆碱酯酶为酶源，2， 6-二氯靛酚乙酸酯为显色剂，2， 6-二氯靛 酚乙酸酯为显色剂国内尚没有，价格昂贵，每250mg达1000元以上。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现.状，旨在提供一种成本低、检测有机磷农药残留量速 度快、灵敏度高的鲫鱼乙酰胆碱酯酶的提取方法及应用。本专利技术目的的实现方式为，乙酰胆碱酯酶的提取方法，分别取鲫鱼脑、肌肉和肝脏 各组织，用pH7.5， 0.1mol/L的磷酸缓冲溶液，在冰浴条件下匀浆，制成匀浆液，匀浆 质量体积比为1: 4，在4。C下，以10000 12000r/min冷冻离心25 30min，得上清 液，即为乙酰胆碱酯酶提取液，保存于冷藏室中。乙酰胆碱酯酶的应用，用于快速检测有机磷农药的残留量，检测方法是以鲫鱼脑乙 酰胆碱酯酶为酶源，以2,6-二氯靛酚钠为显色剂，以定性滤纸为载体并以吸附法固定化酶制得有机磷农药快速检测试纸，具体操作步骤如下取一张硬纸片，对称地粘上直径10土2mm的小滤纸片， 一边加入润湿滤纸量的， 浓度为0.5%的2,6-二氯靛酚钠溶液和润湿滤纸量的，浓度为100mmol/L的碘化硫代乙 酰胆碱溶液，另一边加上润湿滤纸量的提取出的鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶溶液，放入冰箱 中冷藏干燥20小时以上，小滤纸片上盖上同样大小的纤维滤膜，检测时，取用有机磷 农药洗脱液湿润的滤纸片，对折使两滤纸片叠合，10-15分钟后观察试纸变色现象，无 有机磷农药存在时试纸在10~15分钟内由蓝色变为无色，有有机磷农药存在时蓝色不 褪或退色不明显。本专利技术分别由鲫鱼脑、肌肉和肝脏各组织提取乙酰胆碱酯酶并以鲫鱼脑乙酰胆碱 酯酶为酶源，首次以DCIP(2,6-二氯靛酚钠)为显色剂，代替2， 6-二氯靛酚乙酸酯，降 低了成本，25gDCIP仅200元；检测有机磷农药残留量快速，仅为15分钟，灵敏度高。附图说明图1为用本专利技术提取的乙酰胆碱酯酶检测敌敌畏的IO分钟显色反应图 图2为用本专利技术提取的乙酰胆碱酯酶检测敌敌畏的15分钟显色反应图 图3为用本专利技术提取的乙酰胆碱酯酶检测敌敌畏的20分钟显色反应及与空白对 照显色图具体实施例方式本专利技术分别取鲫鱼鱼脑、肌肉和肝脏各组织，用磷酸缓冲溶液匀浆，冷冻离心，得 上清液，即为乙酰胆碱酯酶酶液，保存于冷藏室中。本申请人作了乙酰胆碱酯酶活性的测定，具体操作是在3.00 mL磷酸盐缓冲液 (0.1mol/L， pH8.0)中加入20pL乙酰胆碱酯酶液，混匀，30。C保温20 min后，依次 加入IO(VLDTNB溶液(20mmol/L)禾口 20jaLATCh(碘化硫代乙酰胆碱)溶液(100mmol/L)，充分混合反应，在412nm处用lcm比色皿比色，每隔0.5min读数， 连续测定3min，酶活力单位定义为每毫克蛋白每分钟催化分解底物lpmol为1个活力 单位U，检测结果按下式计算五i式中 i 一酶活抑制率(％)El —无农药抑制时的酶液活性(U)E2—某一浓度农药抑制时酶液的活性(U)。 本申请人利用鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶作为酶源，以DCIP(2,6-二氯靛鼢钠， 2，6-Dichloroindophenol sodium salt hydrate)为显色剂，建立了有机磷农药敌敌畏、乐果、 辛硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷的和三唑磷的DTNB比色快速检测方法。并利用吸附法固定化酶制得了有机磷农药快速检测试纸，试纸上的酶活至少可保留20天。试纸变色现 象为无农药时试制在10~15分钟内由蓝色变为无色，而有农药存在时蓝色不褪或褪色 不明显，农药浓度越高现象越明显。利用快速检测试纸检测四种有机磷农药，以敌敌 畏的灵敏度最高，在浓度为O.lUg/mL时即可检测出，而辛硫磷和乐果次之，检出浓 度为lug/mL，三唑磷灵敏度最低，检出浓度为5ug/mL。参照图1，从图中可见，敌敌畏浓度为10吗/ml、 lng/ml和0.1吗/ ml时10分钟 显色反应后的颜色由深至浅，证明浓度越高，蓝色越深；参照图2，从图中可见，敌敌 畏浓度为10pg/ml、 lpg/ml和0.1pg/ml时15分钟显色反应后的颜色由深至浅，证明浓 度越高，蓝色越深；参照图3，从图中可见，敌敌畏浓度为1(Hig/ml、 l吗/ml和0.1jig/ ml时20分钟后的显色反应现象，浓度越高，蓝色越深，而空白的蓝色几乎没有，由此 证明，用本专利技术提取的乙酰胆碱酯酶检测有机磷农药残留量快速，灵敏度高。权利要求1、乙酰胆碱酯酶的提取方法，其特征在于分别取鲫鱼脑、肌肉和肝脏各组织，用pH7.5，0.1mol/L的磷酸缓冲溶液，在冰浴条件下匀浆，制成匀浆液，匀浆质量体积比为1∶4，在4℃下，以10000～12000r/min冷冻离心25～30min，得上清液，即为乙酰胆碱酯酶提取液，保存于冷藏室中。2、 乙酰胆碱酯酶的应用，其特征在于用于快速检测有机磷农药的残留量，检测方 法是以鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶为酶源，以2，6-二氯靛酚钠为显色剂，以定性滤纸为载体并 以吸附法固定化酶制得有机磷农药快速检测试纸，具体操作步骤如下取一张硬纸片，对称地粘上直径10土2mm的小滤纸片， 一边加入润湿滤纸量的， 浓度为0.5%的2，6-二氯靛酚钠溶液和润湿滤纸量的，浓度为100mmol/L的碘化硫代乙 酰胆碱溶液，另一边加上润湿滤纸量的提取出的鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶溶液，放入冰箱 中冷藏干燥20小时以上，小滤纸片上盖上同样大小的纤维滤膜，检测时，取用有机磷 农药洗脱液湿润的滤纸片，对折使两滤纸片叠合，10 15分钟后观察试纸变色现象，无 有机磷农药存在时试纸在10 15分钟内由蓝色变为无色，有有机磷农药存在时蓝色不 褪或褪色不明显。全文摘要乙酰胆碱酯酶的提取方法及应用，涉及一种提取鲫鱼乙酰胆碱酯酶的方法及用其检测有机磷农药残留量的方法。提取法如下鲫鱼的组织用磷酸缓冲溶液在冰浴条件下匀浆，冷冻离心，得酶液。检测方法是以鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶为酶源，以2，6-二氯靛酚钠为显色剂，以定性滤纸为载体，以吸附法固本文档来自技高网...

【技术保护点】
乙酰胆碱酯酶的提取方法，其特征在于分别取鲫鱼脑、肌肉和肝脏各组织，用ｐＨ７．５，０．１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲溶液，在冰浴条件下匀浆，制成匀浆液，匀浆质量体积比为１∶４，在４℃下，以１００００～１２０００ｒ／ｍｉｎ冷冻离心２５～３０ｍｉｎ，得上清液，即为乙酰胆碱酯酶提取液，保存于冷藏室中。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓宇，吴谋成，徐盈，杨健，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[]