坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建方法及其应用技术

坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建方法及其应用，涉及一种坛紫菜的指纹图谱，尤其是涉及一种坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建方法及其应用。提供一种快速、准确的坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建方法及其在实现坛紫菜种质鉴定自动化的应用。收集坛紫菜样品；各样品基因组ＤＮＡ的提取与纯化；ＰＣＲ扩增：利用所提取的基因组ＤＮＡ作为模板，以经过优化的实验体系进行ＳＲＡＰ分子标记分析；选择具有代表性的ＳＲＡＰ多态性条带用于构建各供试样品的ＤＮＡ指纹图谱；将构建的ＤＮＡ指纹图谱转化成为计算机可以识别的数码指纹，并输入指纹图谱识别软件中，建立坛紫菜种质的数码指纹库，用于后续的坛紫菜种质鉴定；坛紫菜种质的自动化鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种坛紫菜的指纹图谱，尤其是涉及一种坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建 方法及其应用。
技术介绍
坛紫菜(尸OA7 /^m/^'to^m^)是我国特有的暖温带性品种，是福建、浙江和广东沿海人 工养殖的重要经济红藻，其产量约占全国紫菜总产量的80%。以往紫菜的分类主要是依靠形 态学的方法，然而由于大多数形态性状受环境因数影响大，可描述的特征有限，已经很难满 足紫菜种质鉴定和良种选育的要求。分子标记技术的出现给这一问题的解决带来了契机，它 直接在DNA水平上标记检测基因组的遗传变异，不受发育时期和环境因素的影响，数量丰 富且多态性好，已经广泛应用于高等植物的种质鉴定中。SRAP——相关序列扩增多态性标记是一种新型的分子标记技术，具有多态性高，产率中 等，重复性好，操作简单，在基因组中分布均匀，较易对扩增得到的目标片段进行测序，引 物具有通用性，而且其正向引物可以与反向引物两两搭配组合，用少量引物即可组配得到多 个引物对，从而提高引物的使用效率，降低引物合成成本等诸多优点，已经广泛用于植物遗 传多样性分析、指纹图谱构建、种质鉴定以及遗传连锁图谱的绘制(参见文献LiGQuirosC F, Sequence-related amplified polymorphism (SRAP)， a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor Appl Genet, 2001， 103: 455-461)，但在海藻中的应用至今未见相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、准确的坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建方法及其在 实现坛紫菜种质鉴定自动化的应用。本专利技术的技术方案是利用一种相关序列扩增多态性标记(Sequence-Related A即lified Polymorphism, SRAP)来标记构建坛紫菜的指纹图谱，并利用所构建的指纹图谱实现坛紫菜 种质鉴定自动化的方法。 本专利技术所述的坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建方法包括以下步骤1) 收集坛紫菜样品；2) 各样品基因组dna的提取与纯化；3) pcr扩增利用所提取的基因组dna作为模板，以经过优化的实验体系进行srap 分子标记分析；4) 选择具有代表性的srap多态性条带用于构建各供试样品的dna指纹图谱；5) 将构建的dna指纹图谱转化成为计算机可以识别的数码指纹，并输入指纹图谱识别 软件中，建立坛紫菜种质的数码指纹库，用于后续的坛紫菜种质鉴定6) 坛紫菜种质的自动化鉴定。坛紫菜样品可收集生产或科学研究上具有代表性的坛紫菜品系，例如表1所示的部分生 产或科学研究上具有代表性的坛紫菜品系。表1生产或科学研究上具有代表性的坛紫菜品系<table>table see original document page 5</column></row><table>各样品基因组dna的提取与纯化的方法可釆用文献提供的方法(可参见文献克拉尔 克著，顾红雅译.植物分子生物学实验手册.北京高等教育出版社，1997)，但将其中的液氮研磨釆用海螺酶酶解替代。各样品基因组DNA的提取可取新鲜的藻体材料，用消毒海水处理后，在匀浆机中匀浆， 后加入酶液，3(TC保温0.5 2h。酶解结束后用无菌水稀释酶解物，筛绢过滤，滤液经3000 8000 r/min， l(TC离心5 10 min，收集细胞，用无菌水悬浮洗涤细胞一次，离心后重新收 集细胞，并收集的细胞转入5ml离心管中用CTAB法提取基因组DNA。其中酶液的组成最好 为2 %海螺酶，2 mo1/1葡萄糖。优化的实验体系可采用正交试验对影响SRAP分子标记分析的各个因素进行优化后所得 到，优化的实验体系包括反应体系、扩增程序及用于PCR扩增的引物对序列三个部分。反应体系为25uL的反应体系中含2. 5yL 10XPCR Buffer, 5ng模板DNA， 2. 5mmol/L Mg2+， l.OUDNA聚合酶，200nmol/L引物，200nmol/L dNTP。扩增程序为95。C预变型5min; 94°C lmin， 35°C lmin， 72°C 2min， 5个循环；94°C lmin, 48°C lmin， 72°C 2min， 35个循环;72°C延伸10min。PCR扩增的引物对序列如表2所示，具体使用时可根据材料的不同使用其中正向引物及 反向引物随机组合的1对或多对引物。表2 PCR扩增所采用的引物编弓及其序列<table>table see original document page 6</column></row><table>选择具有代表性的SRAP多态性条带的原则是利用最少对引物，最少条带，就能将所有 供试样品完全分开(即每个样品利用所选择的多态性条带构建的指纹图谱都具有唯一性)， 且选取的条带具有稳定性和重复性良好、多态性高的特点。选择具有代表性的SRAP多态性条带用于构建各供试样品的DNA指纹图谱的方法是以坛紫菜品系编号为横坐标，以选择的具有代表性的SRAP多态性条带的编号为纵坐标，在每 一纵横坐标交结处，有扩增带用"一"表示，没有扩增带不作任何标记，由此即可构建出各 个坛紫菜样品的DNA指纹图谱，且所构建的每个坛紫菜样品的DNA指纹图谱都具有唯一性。将构建的DNA指纹图谱转化成为计算机可以识别的数码指纹，并输入指纹图谱识别软 件中，建立坛紫菜种质的数码指纹库的方法是在所构建的DNA指纹图谱中，用"1"和"0" 分别代表图谱中扩增带的有和无，这样就可以将DNA指纹图谱转化为由"1"和"0"组成 的数码指纹，使得每个材料都具有各自特异的由"1"和"0"组成的数码指纹，然后即可将 各个材料名称、特征及其对应的数码指纹输入指纹图谱识别软件中构建坛紫菜的数码指纹库， 用于后续的坛紫菜种质鉴定。实现坛紫菜种质鉴定自动化的应用的方法是当需对一批坛紫菜进行种质鉴定时，只需对 每个样品进行指定引物的SRAP标记分析，按照构建指纹库时选定的多态性条带的有无绘制出 坛紫菜各样品的DNA指纹图谱，并转化为由"1"和"0"组成的数码指纹，再将每个样品 的数码指纹输入配套的指纹图谱识别软件中，软件通过比较计算并可自动给出该样品属于已 建库品系中的哪一个，若该样品不属于已建库品系中的任何一个，则软件会显示这是一个新 材料，并给出该样品与每个已建库品系的相似系数，继而提示是否将该新材料加入数据库中。本专利技术具有如下优点1)本专利技术采用DNA分子标记技术来构建坛紫菜的指纹图谱，直接 从DNA水平标记各坛紫菜种质的遗传差异，不受发育时期和环境因素的影响，因此结果更为 准确、可靠；2)本专利技术提供了一套简单有效的提取坛紫菜高质量DNA的方法；3)本专利技术对 PCR扩增的反应体系及扩增程序进行了优化，避免了试验过程人为产生的误差，使结果更为 稳定和可靠；4)采用本专利技术构建的坛紫菜DNA数码指纹，可以根据需要不断增加，并对指纹 进行更新，以满足发展的需要；5)本文档来自技高网...

【技术保护点】
坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建方法，其特征在于包括以下步骤：１）收集坛紫菜样品；２）各样品基因组ＤＮＡ的提取与纯化；３）ＰＣＲ扩增：利用所提取的基因组ＤＮＡ作为模板，以经过优化的实验体系进行ＳＲＡＰ分子标记分析；４）选择具有代表性的ＳＲＡＰ多态性条带用于构建各供试样品的ＤＮＡ指纹图谱；５）将构建的ＤＮＡ指纹图谱转化成为计算机可以识别的数码指纹，并输入指纹图谱识别软件中，建立坛紫菜种质的数码指纹库，用于后续的坛紫菜种质鉴定；６）坛紫菜种质的自动化鉴定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈昌生，谢潮添，纪德华，徐燕，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]