采集扇贝高浓度精液的方法技术

一种采集扇贝高浓度精液的方法，它的方法包括：优质亲贝的培育、制备吸取精液的吸头、高浓度精液的采集、检测收集精子的活力。该方法是采用截去尖端的２００μＬ吸头在性腺充分成熟的扇贝肾孔端附近扎破肾管并吸取精液，所获得的精液仅含有少量组织残迹和生理组分，精液浓度高，为０．２－１．６×１０↑［９］个／ｍＬ；成熟度高，达１００％，其接触海水的量非常少，因而没有完全被激活。８－９ｃｍ的雄性虾夷扇贝，可收集到约１．５ｍＬ精液／只；６－７ｃｍ的雄性栉孔扇贝，可收集到约０．６ｍＬ精液／只。通过精子冷冻保存和授精试验验证，采用这种精液收集方式所收集的扇贝精液可应用于生产和研究当中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋生物
，系贝类遗传育种研究中的技术改进，是一种在扇贝繁殖盛期采集高浓度、高成熟率和低激活率扇贝精液的技术方法。
技术介绍
精液的采集一般是指人工授精研究或在生殖障碍研究中以获取精液为研究对象的技术方法。 目前收集贝类精液大多采用解剖法和自然排放法，前者不能保证所得到的精子完全成熟，后者不能避免精子过早被海水激活。如鲍鱼精液的收集通常采用阴干和升温相结合诱导亲鲍排精，再离心浓缩产至海水中的精子，但离心浓缩所得到精子因长时间与海水接触，能量损失相对较多；Hughes(Cryobiology，1973，10342-344)和Zell等(Cryobiology，1979，16448-460)研究表明这种海水—精子混合物用于牡蛎精子冷冻效果并不理想，而采用解剖性腺组织的方法获得精液比较成功，但同样不能保证所获得的精子完全成熟，且精液中残留不少其它的组织细胞。通过对扇贝的精子冷冻保存及授精试验，发现一种采集高浓度、高成熟率和低激活率扇贝精液的方法，目前尚未见有关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是采用一种便捷的方法收集到高浓度、高成熟率和低激活率的扇贝精子，以适用于精子冷冻保存和授精试验的研究，为克服扇贝育种过程中远缘杂交生殖隔离以及不同地域不同时间开展品种改良的难题铺平道路，以期在培育出生长快、抗逆能力强的优质亲贝的基础上，收集高浓度且品质佳的扇贝精液，用于培育优质苗种，从而有效遏制目前存在的品质下降，大面积死亡问题，为扇贝养殖业的持续稳定发展提供了一条新的出路。 本专利技术是按照以下操作方法完成的 它的方法包括1、优质亲贝的培育；2、制备吸取精液的吸头；3、高浓度精液的采集；4、检测收集精子的活力。 1、优质亲贝的培育以壳高为标准，从养殖海区选择生长速度快，健康活泼的雄性扇贝进行暂养。虾夷扇贝壳高9～11cm，暂养密度每立方米水体20个，暂养水温4～8℃；栉孔扇贝壳高6～7cm，暂养密度每立方米水体80个，暂养水温14～16℃。投喂硅藻、金藻及螺旋藻，每天倒池一次。 2、制备吸取精液的吸头材料为200μL黄颜色的吸头，吸头尖端用锋利的刀片略微倾斜削去部分(0.5-1cm)并修平整，使其既能在肾孔端附近扎破肾管，又可尽量减少吸力和毛边对精子的机械损伤。 3、高浓度精液的采集待亲贝性腺充分成熟、个别出现排精现象时，挑选性腺饱满的雄贝，阴干升温刺激使其排放精子，观察到排精后，立即从海水中取出，用制备的200μl吸头，在肾孔端附近扎破肾管并吸取精液，放入冰上预冷的Eppendorf管中备用。 4、检测所收集精子的活力取5μL精液，用195μL海水稀释40倍，将计数板放于显微镜的载物台上，盖上盖玻片；迅速取一滴稀释的精液于血球计数板盖玻片的边缘使精液自动均匀渗进计数室；置于200倍或400倍显微镜下观察精子活动情况，借助计数板上的标准网格进行目测计数，观察精子浓度及各活动类型的精子数目；精子的活动有三种类型前进运动、旋转运动和仅尾巴摆动运动，评价精子活力是根据前进运动精子数多少及其占全部精子数的百分比来确定，所测精子的活力达到80-100％。 与已有技术对比，本专利技术技术具有如下特点 1.收集方法简单，易于操作。只需了解扇贝的生殖腺及排泄器官的解剖结构，精确辨别出肾管便可进行精液的采集。一般雄性虾夷扇贝通过该方法可收集到约1.5mL精液/只，栉孔扇贝可收集到约0.6mL精液/只。 2.采用本方法获得的精液浓度高，为0.2-1.6×109个/mL；成熟度也高，高达100％，因为精子只有充分成熟以后才能连同精液一起排放到肾管中，再从肾孔排出至体外；肾管中的海水很少，因而精子基本上不被激活。 具体实施例方式 下面通过具体实施例对本专利技术进行详细说明 最佳实施例具体操作工艺过程 2005年3-6月份，以壳高为标准，选择生长速度快，健康活泼的扇贝进行暂养，建立优质亲贝群体；从此群体中挑选性腺发育成熟的雄性个体，用200μL黄颜色的吸头在肾孔端附近扎破肾管，吸取并收集精液。通过精子活力监测、超低温冷冻保存及授精试验，证明本方法所获得的精液具有高浓度、高成熟度和低激活率的特点。 完成上述操作过程具体操作如下 其步骤包括1.优质亲贝的培育；2.亲贝生殖系统和排泄系统的结构观察；3.制备吸取精液的吸头；4.精液收集方法的比较及精子质量的评价；5.验证检测后的精液质量。 1.优质亲贝的培育 以壳高为标准，选择生长速度快，健康活泼的雄性扇贝进行暂养。3月份，从养殖海区挑选壳高9～11cm的虾夷扇贝雄贝，移入室内进行暂养，暂养密度每立方米水体20个，暂养水温由开始的3-4℃，每天升温1℃至8℃恒温培育；4月份，从养殖海区挑选壳高6～7cm的栉孔扇贝雄贝，移入室内进行暂养，暂养密度每立方米水体80个，暂养水温由开始的12-13℃，每天升温1℃至16℃恒温培育。暂养过程中每天倒池一次，投喂硅藻、金藻及螺旋藻。 2.亲贝生殖系统和排泄系统的结构观察 2005年4月份，对亲贝扇贝泄殖系统的结构进行解剖观察，扇贝的主要生殖器官为一对囊状的生殖腺，排泄器官为一对肾脏，肾脏各由一海绵状腺体及一具纤毛的薄壁短管状体构成，前者的肾口开口于围心腔；后者的肾孔(泄殖孔)开口于外套腔中，附于闭壳肌的前方，介于生殖腺及左右两鳃之间，呈长囊形。代谢废物和生殖产物都由肾孔排出。肾孔位于肾的末端腹面。生殖腺的前端两侧突出部上，左右各有一个约1毫米长的裂缝，与肾脏相通，称肾生殖孔。在繁殖季节，成熟个体的生殖腺极为饱满，成熟的精子或卵子通过左右两侧的裂孔进入肾脏，然后从左右肾孔(泄殖孔)排出体外。肾管中的精液仅含有少量组织残迹和生理组分，精液浓度高，为0.2-1.6×109个/mL。 3.制备吸取精液的吸头在准备收集精液之前，将96支200μL黄颜色的吸头尖端用锋利的刀片略微倾斜削去部分(0.5-1cm)并修平整，使其既能在肾孔端附近扎破肾管，又可尽量减少吸力和毛边对精子的机械损伤。制备好的枪头装入枪头盒中，密闭高温高压消毒备用。 4.精液收集方法的比较及精子质量的评价 雄贝性腺发育成熟时，采用三种不同的方法收集精液A.解剖法将性腺剪切成碎块放于500目筛绢上，海水冲洗滤出精液至冰上预冷的小烧杯中；B.肾管处吸取法阴干升温刺激雄贝，排精后立即从海水中取出，用200μl的吸头在肾管处吸取精液，放入冰上预冷的Eppendorf管中备用，对于普通大小的雄性虾夷扇贝，通过该方法可收集到约1.5mL精液/只，对于一般大小的雄性栉孔扇贝，可收集到约0.6mL精液/只；C.离心浓缩法用离心管收集排入海水中的精液，经冷冻离心，浓缩的精液存于10ml离心管内冰上预冷备用。为消除扇贝个体间的差异，每种方法收集的精液均来源于同一批扇贝的多个个体。 取5μL精液，用195μL海水稀释40倍，将擦洗干净的计数板放于显微镜的载物台上，盖上盖玻片。迅速取一滴稀释的精液于血球计数板盖玻片的边缘使精液自动渗进计数室，注意不要使精液溢出盖玻片，并不可使精液不够而致计数室内有气泡或干燥之处，如有这些现象应重做。置于200倍或400倍暗视野显微镜下观察精子活动情况，借助计数板上的标准网格进行目测计数，估计精子浓度，观察活动与不活动的精子数目。数本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采集扇贝高浓度精液的方法，其特征在于它的方法包括：１）、优质亲贝的培育；２）、制备吸取精液的吸头；３）、高浓度精液的采集；４）、检测收集精子的活力。１）、优质亲贝的培育：以壳高为标准，从养殖海区选择生长速度快，健康活泼的雄性扇贝进行暂养；虾夷扇贝壳高９～１１ｃｍ，暂养密度每立方米水体２０个，暂养水温４～８℃；栉孔扇贝壳高６～７ｃｍ，暂养密度每立方米水体８０个，暂养水温１４～１６℃；投喂硅藻、金藻及螺旋藻，每天倒池一次；２）、制备吸取精液的吸头：材料为２００μＬ黄颜色的吸头，吸头尖端用锋利的刀片略微倾斜削去０．５－１ｃｍ，并修平整毛边；３）、高浓度精液的采集：待亲贝性腺充分成熟、个别出现排精现象时，挑选性腺饱满的雄贝，阴干升温刺激使其排放精子，观察到排精后，立即从海水中取出，用制备的２００μｌ吸头，在肾孔端附近扎破肾管并吸取精液，放入冰上预冷的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中备用；４）、检测所收集精子的活力：取５μＬ精液，用１９５μＬ海水稀释４０倍，将计数板放于显微镜的载物台上，盖上盖玻片；迅速取一滴稀释的精液于血球计数板盖玻片的边缘使精液自动均匀渗进计数室；置于２００倍或４００倍显微镜下观察精子活动情况，借助计数板上的标准网格进行目测计数，观察精子浓度及各活动类型的精子数目，评价精子活力是根据精子活动类型其前进运动精子数的多少及其占全部精子数的百分比来确定，即所测精子的活力达到８０－１００％；。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨爱国，周丽青，刘志鸿，杨培民，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]