一种３－甲基－喹啉－２－羧酸的免疫磁珠检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明专利技术是利用磁珠作为固相载体，通过检测化学发光信号检测３－甲基－喹啉－２－羧酸，包括包被原、免疫源和抗体的制备，包被原的固定以及化学发光的检测；大大提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以铁磁微粒作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，大大满足国内对其检测的需要。
【技术实现步骤摘要】
，属于免疫分析化学
技术介绍
3-甲基-喹啉-2-羧酸，英文名称3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid (MQCA)，是喹噁啉类饲料添加剂在动物体内的代谢产物，以喹诺酮和喹乙醇 为主要代表。当鸡、猪、鱼等食用此类饲料添加剂后，会在体内，主要是肌肉， 肠道，肾脏中代谢生成3-甲基-喹啉-2-羧酸，这种代谢物对人体毒性极大。由于 国内对喹啉类添加剂的大量滥用，造成了添加剂在动物体内的含量严重超标， 国内的检测技术尚停留在对原药的检测。随着国际标准的提高，我国贸易的国 际化，这种检测要求已经不能满足要求。近年来，国外开始逐渐加大了对代谢 物3-甲基-喹啉-2-羧酸的研究和检测。为了与国际接轨，减少我国的肉类制品在 出口时不必要的损失，我国有必要加大对代谢物的研究力度，由于对其研究较 少，检测限仍然较高，为了弥补这一空白，有必要研究一种灵敏度高，检测限 低，操作简单的，针对3-甲基-喹啉-2-羧酸的检测方法。HPLC和LC-MS/MS的方法虽然灵敏，但是所需仪器价格昂贵，对操作人 员的要求较高，较难推广。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，针对3-甲基-喹啉-2-羧酸的检测，灵敏度高，操作方便，线性范围宽。本专利技术的技术方案 ，利用磁 珠作为固相载体，通过检测化学发光信号检测3-甲基-喹啉-2-羧酸，包括包被原、 免疫源和抗体的制备，包被原的固定以及化学发光的检测；工艺步骤为(1) 包被原的制备将3-甲基-喹啉-2-羧酸与间氨基苯甲酸相连，再与卵清蛋白偶联得到包被原；(2) 免疫源的制备将3-甲基-喹啉-2-羧酸与牛血清蛋白偶联得到免疫源；(3) 抗体的制备用步骤(2)得到的免疫源免疫兔子得到特异性兔多克隆抗体；(4) 磁性纳米粒子修饰用3-氨丙基三乙氧基硅垸修饰Fe304磁性纳米颗粒；(5) 包被原的固定将步骤(l)得到的包被原与磁性微粒偶联，并固定在玻璃微通道内；(6) 流动注射化学发光的检测利用间接竞争免疫检测原理，将3-甲基-喹啉-2-羧酸和步骤(3)得到的抗体通 过玻璃微通道内，竞争结合后的抗体与辣根过氧化氢酶标记的羊抗兔IgG反应 后，利用辣根过氧化氢酶催化对碘苯酚增强的鲁米诺-过氧化氢体系化学发光， 检测3-甲基-喹啉-2-羧酸。包被原的制备取3-甲基-喹啉-2-羧酸0.1mmo1，溶解在6mLN,N-二甲基甲酰胺中，加入 120pL三正丁胺，反应0.5小时，再加入75)iL氯甲酸异丁酯，反应1小时，再与含 有O.lmmol间氨基苯甲酸的pH9.6碳酸钠缓冲溶液混合，在4'C下搅拌反应2小 时，过程中有沉淀产生，离心，取沉淀物，干燥，得到半抗原；取半抗原O.lmmol， N-羟基琥珀酰亚胺O.lmmol， N，N-二环已基二亚胺O.lmmol，加入到3mLN，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白溶液 在4'C下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20°<:保存备用。免疫源的制备取3-甲基-喹啉-2-羧酸O.lmmol， N-羟基琥珀酰亚胺 O.lmmol， N，N-二环已基二亚胺O.lmmol，加入到3mLN,N-二甲基甲酰胺中，室 温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白溶液在4'C下搅拌反应 过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-20'C保存备用。磁性纳米粒子的修饰用二次蒸馏水分别配制FeS(V7H20和FeCl3*6H20 的溶液及NaOH溶液，将所配两种铁盐溶液混合，在铁盐的混合溶液中Fe"离 子的浓度为0.12mol/L，FeS+的浓度为0.2 mol/L;NaOH溶液的浓度为2.5 mol/L; 在剧烈搅拌下将NaOH溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60°C 陈化2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在6(TC干燥24小时， 在玛瑙研钵中研磨后所得产物为Fe304种子；将所得产物Fe304种子0.125g分散 在100mL乙醇和lmL水混合液中，超声30min，滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基 硅垸，室温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将3-氨丙基三乙氧基硅烷修 饰的Fe304纳米颗粒从反应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再 在6(TC干燥24小时，备用。磁性纳米粒子与包被原的偶联取3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的Fe304纳米 颗粒10mg，N-羟基琥珀酰亚胺11.5mg，N，N-二环已基二亚胺20.63mg，加入到3mL N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL包被原 溶液在4'C下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液 进行磁性分离，弃上清，得到粗磁粒-包被原的复合物，加入lmL含2%明胶的封闭液封闭，再用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤液洗涤，洗涤后磁分离，去上 清，最后加入lmL0.02mol/LpH7.6的Tris缓冲液，4匸保存备用。流动注射化学发光的检测将25^L磁粒-包被原的复合物注入玻璃微通道并 以电磁铁固定，用蠕动泵注入50nL3-甲基-喹啉-2-羧酸的标准品0.02ng/mL、 0.04ng/mL、 0.06ng/mL、 0.08ng/mL、 0.1ng/mL和50)iL 10^lg/mL的3-甲基-喹啉-2-羧酸的抗体混合液反应5分钟后， 用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液清洗30s，再 加入50pL 0.3|ig/mL辣根过氧化氢酶标记的羊抗兔IgG反应5分钟，洗掉游离的辣 根过氧化氢酶标记的抗体后，注入5xl(rSmol/L路米诺和5xl(rVol/L过氧化氢， 在流动注射化学分光光度仪上测定发光强度。本专利技术的有益效果免疫分析化学方法具有快速，灵敏度高，操作简单， 专一性好等优点。与传统的ELISA方法相比，本专利技术利用磁珠作为固相载体， 通过检测化学发光信号检测3-甲基-喹啉-2-羧酸，大大提高了检测的灵敏度，且 操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以铁磁微粒作为固相载体，具有清 洗和分离方便，操作简单的优点。 附图说明图l包被原的紫外扫描图。图2 3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测原理图。图3 3-甲基-喹啉-2-羧酸的免疫磁珠检测线性范围图。具体实施方式实施例1(1) 包被原的制备取3-甲基-喹啉-2-羧酸188mg，溶解在6mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，力口 入120pL三正丁胺，反应0.5小时，再加入75pL氯甲酸异丁酯，反应1小时，再与 含有100mg间氨基苯甲酸的碳酸钠缓冲液(pH9.6)混合，在4'C下搅拌反应2小时， 过程中有沉淀产生，离心，取沉淀物，干燥，得到半抗原。取半抗原9.9mg, N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 11.5mg， N,N-二环已基二亚胺 (DCC) 20.63mg，加入至U3mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应过夜， 离心去沉淀，上清液再与3mL卵清蛋白(OVA) (60mg)溶液在4"C下搅拌反应 过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，冻干，-2(TC保存备用。(2) 免疫源的制备取3-甲基-喹啉-2-羧酸188mg， N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 11本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种３－甲基－喹啉－２－羧酸的免疫磁珠检测方法，其特征是利用磁珠作为固相载体，通过检测化学发光信号检测３－甲基－喹啉－２－羧酸，包括包被原、免疫源和抗体的制备，包被原的固定以及化学发光的检测；工艺步骤为：（１）包被原的制备：将３－甲基－喹啉－２－羧酸与间氨基苯甲酸相连，再与卵清蛋白偶联得到包被原；（２）免疫源的制备：将３－甲基－喹啉－２－羧酸与牛血清蛋白偶联得到免疫源；（３）抗体的制备：用步骤（２）得到的免疫源免疫兔子得到特异性兔多克隆抗体；（４）磁性纳米粒子修饰：用３－氨丙基三乙氧基硅烷修饰Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］磁性纳米颗粒；（５）包被原的固定：将步骤（１）得到的包被原与磁性微粒偶联，并固定在玻璃微通道内；（６）流动注射化学发光的检测：利用间接竞争免疫检测原理，将３－甲基－喹啉－２－羧酸和步骤（３）得到的抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的抗体与辣根过氧化氢酶标记的羊抗兔ＩｇＧ反应后，利用辣根过氧化氢酶催化对碘苯酚增强的鲁米诺－过氧化氢体系化学发光，检测３－甲基－喹啉－２－羧酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，冀宝庆，陈伟，贾承胜，秦昉，陶冠军，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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