一种卵母细胞石蜡切片的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种卵母细胞石蜡切片的制备方法，本发明专利技术方法包括固定、脱水、透明处理以及石蜡包埋和切片等步骤，本发明专利技术方法在固定脱水透明处理等过程中使卵母细胞在液体环境中转移，并且全程没有外力直接作用，因此可以使得卵母细胞最大程度上保持原始的形态结构；使用无色透明器皿盛装卵母细胞，使得卵母细胞清晰可见；卵母细胞转移到模盒后，将二甲苯去除，露出卵母细胞，可以更容易地找到卵母细胞；在石蜡包埋前，在卵母细胞周围撒上有色颗粒，可以便于卵母细胞在石蜡中定位。本发明专利技术方法可以对少量甚至单个的直径在１００微米到６００微米的禽类卵母细胞进行石蜡切片的制作，获得的切片结构清晰完整，染色效果好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及 一种石蜡切片的制备方法，具体地说是 一种卵母细胞 石蜡切片的制备方法，本专利技术方法特别适用于禽类卵巢细胞切片的制 备。
技术介绍
免疫组织化学(Immunochistochemistry)又称免疫细胞化学是指 运用免疫学原理，通过特异的抗原抗体结合反应，并对抗体标记上 可见的显色物来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。可 以识别定位细胞中的各种组织成分，如酶、多肽、核酸、多糖、激 素等，最后通过特异性染色可以在光学显微镜或荧光显微镜下观察 其所在细胞中准确位置，利用细胞分光光度计、图像分析仪可对检 测物进行细胞的原位定量测定。免疫组织化学技术特异性强、灵敏 度高、定位准确并且简便快速，能够有机的同形态、功能及代谢的 研究结合起来，适合具体研究组织和细胞中的一些理化因子的分布 和功能。免疫组化检测通常需要先对样本进行包埋制片处理，如石 蜡切片，冰冻切片等。在样本切片上进行理化因子的免疫学检测。生物显微制片技术是研究细胞结构与组织化学的主要方法，而 石蜡切片的制作是组织学和病理学中最常用的一种方法，适合于免 疫组化检测的样本石蜡切片组织平面平整，厚薄适当，完整地保留 组织的结构形态，染色效果好，反差强，并且可以长时间的保存。 随着细胞生物学的发展和体外培养技术的进步，通过细胞培养研究 卵母细胞的生长发育愈渐深入，对于卵母细胞结构尤其是关于其生 长发育过程中的一些基因表达的产物和调控激素类物质的作用更是 人们研究的热点之一，以往关于卵母细胞的发育研究通常釆用卵巢局部组织切片来获得卵母细胞的生长发育信息，对局部卵巢组织进 行切片优点是一张切片中可以包含很多处于不同发育时期的卵母细 胞，缺点是由于其中除含有卵母细胞外还有疏松结締组织等其它成 分，在样本的脱水过程中由于其所含多种组织性质的不均一，导致 缩水程度不一致，最后卵母细胞发生形变，无法保持其原有的形态 结构；并且在免疫组化检测中会消耗大量昂贵的抗体，不仅不能使 卵母细胞的特异性检测效果增强反而会导致非卵母细胞特异性染色 的发生，增加背景干扰程度。如果要研究某个重要调控因子在雌性 家禽卵母细胞中的作用，运用卵巢切片的方法还必须在不同时期杀 死多只雌禽取样，这样不仅耗时耗力成本加大，周期延长，而且个 体针对性不强，检测的准确性不高，置信区间变宽。现在细胞体外培养的技术和条件均已成熟和完善，雌禽卵巢上 卵母细胞的分离培养技术也已建立， 一只雌禽卵巢上分离的卵母细 胞在体外就可以培养到不同的发育阶段，因此越来越多的学者投向 对家禽卵母细胞体外培养过程的研究，体外分离得到或经体外培养的家禽卵母细胞的初期直径通常小于400pm,石蜡包埋切片前的酒精脱水和二甲苯透明等复杂工序极易造成卵母细胞的结构破坏和丢失，所以广泛用于卵巢组织切片的常规石蜡包埋制片的方法，并不适合于少量甚至单个卵母细胞的切片制作，这为利用生物显微制片技术来对卵母细胞发育过程中的形态观察及一些理化因子的免疫组化检测带来不便。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述不足提供一种卵母细胞石蜡切片的 制备方法，用于对微小卵母细胞样本制备石蜡切片，本专利技术方法特 别适用于制备禽类卵母细胞切片。本专利技术方法包括如下步骤1、固定将卵母细胞样本用吸管转移到含有固定液的无色透明 器皿中固定过夜，所述的固定液有10%的甲醛溶液、80-95%的乙醇 溶液或5%醋酸溶液；2、 脱水及透明处理用移液枪将卵母细胞从固定液中吸出，经 脱水后，用移液枪将脱水后的卵母细胞转移到含有透明处理液的无 色透明器皿中进行透明处理，所述的透明处理液为二甲苯、苯、甲 苯或氯仿；3、 包埋及切片将透明处理后的卵母细胞用移液枪转移到模盒 中，去除透明处理液，露出卵母细胞，在卵母细胞周围点上有色染 料，经石蜡包埋后切片。本专利技术中的卵母细胞可以是从母体卵巢中中直接分离的卵母细 胞也可以是经体外培养获得的卵母细胞；所用的透明器皿可以是玻 璃器皿；可以用不同浓度梯度的酒精逐级脱水，具体可釆用75%， 85%， 95%以及100%的酒精逐级脱水，每个梯度处理l小时；透明 处理以l小时为宜；卵母细胞转移到模盒后，可以让透明处理液适当挥发或将其吸出，露出卵母细胞，以便观察和操作；所用的染料 可以是伊红、品红、番红或次甲紫等不与石蜡反应的染料；可用常 规程序包埋和切片。本专利技术方法使卵母细胞在液体环境中转移，并且全程没有外力 直接作用，因此可以减少卵母细胞形态和结构的改变，使得卵母细 胞最大程度上保持原始的形态结构；使用无色透明器皿盛装卵母细 胞，可以使得卵母细胞清晰可见；卵母细胞转移到模盒后，将二甲 苯去除，露出卵母细胞，可以更容易地找到卵母细胞；在卵母细胞 周围点上染料再进行包埋，可以便于卵母细胞在石蜡中定位。本专利技术的另一个目的在于提供上述方法制备得到的卵母细胞切 片，其不含有间质细胞等不需要的部分，便于染色，观察和检测。本专利技术结合原有的石蜡切片技术并对之进行了改进创新，降低 了成本，简化了工艺，使其对于少量甚至单个的直径在100微米到 600微米的禽类卵母细胞也可以进行石蜡切片的制作。获得的切片结 构清晰完整，经HE染色可以获得良好的染色和观察效果，结合运 用免疫组化和原位杂交技术，可以更加准确的观察到卵母细胞在体 外培养的不同时间，不同发育时期的不同调控蛋白和激素的作用， 为研究体外培养的卵母细胞的动态发育过程提供了一种高效，简洁， 低耗的新方法。本专利技术方法具有如下优点1. 简单有效，用具易得，成本低廉，可操作性好，可重复度高；2. 使卵母细胞在液体的环境中转移，卵母细胞的原始形态结构 可以最大程度的保留；3. 可以清晰地反映细胞的结构和组织学特征，染色效果好；4. 同一样本可以获得的多张石蜡切片，可长期保存；5. 可以对同一卵母细胞进行多项不同分子和生化学指标的检测, 检测时抗体使用量较卵巢组织切片大为减少并且没有引入卵巢切片 带来的个体间遗传差异；6. 检测信号清晰，定位准确，结果对比度高，由于没有其他组 织的残留，非特异性染色少，没有背景干扰，反映了单个卵母细胞 的生存状态，在卵母细胞的体外培养研究方面应用前景广阔。附图说明图l是经透明处理后的卵母细胞； 图2是模盒中卵母细胞所在位置； 图3是去除二甲苯后露出的卵母细胞； 图4是经石蜡包埋后的卵母细胞(在有色颗粒中心)； 图5是经染色后卵母细胞切片。具体实施方式下面实施例用于对本专利技术的进 一步说明，但不用来限制本专利技术的 范围。实施例1卵母细胞切片的制备本例以禽类卵母细胞为样本来制备卵巢细胞石蜡切片，具体包括如下步骤1. 卵母细胞的取材与固定选取产蛋纪录好的母鸡处死获取卵巢， 剥取卵母细胞并体外培养，将体外培养不同时间的卵母细胞在实体 解剖镜下用玻璃吸管吸出，置于含有10%中性甲醛的玻璃瓶中固定 过夜；2. 卵母细胞的脱水与透明处理取4个玻璃瓶，加入75%, 85%, 95%, 100%酒精，约2/3容积。用移液枪将甲醛固定液中的卵母细 胞吸出，从75%到100%酒精逐级脱水，各1小时。将脱水后的卵母 细胞用移液枪吸到一个小脚量杯(10ml)中，注入5ml二甲苯透明1 小时，量杯封口；3. 卵母细胞的包埋将小脚量杯中的卵母细胞用移液枪吸出，置于 不锈钢模盒中，将模盒置于室外使二甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卵母细胞切片的制备方法，该方法包括如下步骤：１）固定：将卵母细胞样本用吸管转移到含有固定液的无色透明器皿中固定过夜；２）脱水及透明处理：用移液枪将卵母细胞从固定液中吸出，经脱水后，用移液枪将脱水后的卵母细胞转移到含有透明 处理液的无色透明器皿中进行透明处理；３）包埋及切片：将透明处理后的卵母细胞用移液枪转移到模盒中，去除透明处理液，露出卵母细胞，在卵母细胞周围点上染料，经石蜡包埋后切片。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李赞东，蒋斌，杜美红，韩海棠，赵晨，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]