合成和标准化的朊病毒感染性材料，及其作为感染性接种物的应用制造技术

本发明专利技术涉及新的、合成的、标准化的、可溶的、可重复的和易于操作的朊病毒类型的感染性材料，其组成为从表达朊病毒蛋白ＰｒＰ并支持所述ＰｒＰ的病原形式ＰｒＰｓｃ复制的稳定转基因细胞获得的细胞裂解液或培养上清液。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利说明合成和标准化的朊病毒感染性材料，及其作为感染性接种物的应用 本专利技术涉及合成的、标准化的朊病毒类材料及其作为感染性接种物的应用。 专利
术语传染性海绵状脑炎(TSE)描述了一组遗传性或获得性疾病，其特征在于已知在人类中可引起中枢神经系统(SNC)退化，如同在其它克雅病(creutzfeld-Jacob disease，CJD)中那样，但是也可以影响其它哺乳动物例如绵羊(羊瘙痒症)和牛(牛海绵状脑炎)。这些疾病的病原因素的性质使得它们被归为一组，称为“非常规传染因子”(NCTAs)。尽管病因因素尚不了解，但是这些疾病的特征是存在被称为朊病毒蛋白(PrP)的细胞外蛋白。PrP在疾病进程中变成不可溶的形式，这样至少部分对抗蛋白酶例如蛋白酶K，并且在细胞中积累，致其死亡。PrP的这种异常和病原形式，被称为PrPsc，是朊病毒蛋白PrP的构象变化的结果。已经证明编码PrP的基因表达或其翻译中的修饰没有变化(P.Brown，Transfusion，41，4333-436，2001和D.Vlkel等，Transfusion，41，441-448，2001)。 我们对于TSE的了解主要来自体外或体内转基因的研究。因此，编码PrPsc的基因已经失活的小鼠，变得对实验诱导的疾病有高度抗性。相反，表达(或过量表达)从患有家族性TSE的患者的PrP基因或外来基因克隆到的病理性转入基因的小鼠和细胞培养物，模拟了相应的疾病，或者对从感染患者获得的、属于转基因同一物种的接种物敏感。转基因细胞系也被用作体外模型，以测试与PrP到PrPsc的构象转变相互作用的分子。 在目前获得的数据基础上，不可能证实引起TSE的感染性因素在血液或血液制品中以传染性形式存在(参见前面P.Brown)。但是，也不可能证明它不存在，一方面由于血液中的水平可能非常低的可能性，另一方面由于对象感染患者后，疾病的潜伏期非常长。 已知某些医药产品的来源，例如，涉及人类或动物来源的生物起始材料，有可能被NCTA污染(血液、器官、骨、皮肤、血浆、胎盘或细胞培养物)，或者是通过用可能污染起始材料(培养基，生长因子)的工艺获得的，因此制药工业目前正在评估用于获得或处理生物医药制品的工艺的效能、用于消除NCTAs的设备去污染步骤的效能、以及最后密闭(confinement)步骤的效能。 由于对于所有NCTAs来说，共同的唯一已知传染性因素(即能够传播疾病的因素)是病原形式的朊病毒蛋白PrPsc，因此，评估的是这些方法在消除或密闭PrPsc方面的效能。 PrPsc的令人吃惊的抗性，事实上预先就排除了使用现有的能够减少例如可低温沉淀的血浆蛋白(因子VIII，von Willebrand因子等)这样的血液制品中的病毒含量的经典的失活方法(例如用TWEEN-TNBP溶剂/去污剂处理)。 现有技术 这些用于评估和/或控制获得或处理生物医药制品的程序的效能、消除PrPsc的设备去污染的效能和密闭步骤的效能的方法，必须包括 -在生物物质被获得、或处理或去污染之前、期间或之后，对其中PrPsc的滴定方法 -以及感染性接种物，即允许生物制品或设备的污染用已知的感染性PrPsc滴度去污染的感染性材料，其中的变化可以监测。 作为PrPsc的滴定方法，下列的方法是已知的。 总的来说，朊病毒感染性滴定通过用不同稀释度的添加PrPsc的待测制品，脑内接种实验室动物来进行，例如已经适应了来自其它动物、特别是金色仓鼠的感染性TSE株的啮齿动物，或表达与感染源PrPsc相同物种的PrP的转基因小鼠。根据在对应于所用稀释度的不同组中感染的动物的数量，可以计算感染滴度。然而，该方法耗时、耗费，并且难以在工业规模上发展。对于绵羊瘙痒症来说，在脑内注射后在金色仓鼠中的潜伏期是75天。 此外，已有滴定方法可用于TSE感染性因素的体外滴定。它们用于以Western印迹(Ironside J.W.等，J.of Thrombosis and Haemostasis，1，1479-1486，2003)或ELISA的PrPsc检测中。这些方法或者包括使用蛋白酶K对待分析的样品进行初步消化，或者包括使用离液序列高的试剂进行变性以从正常蛋白(PrP)中鉴别病原性蛋白(PrPsc)。事实上，抗体检测的是对蛋白酶K有抗性的朊病毒蛋白片段，被称为PrPres。最近，在使用不识别PrP的特异性PrPsc抗体的基础上开发了另一种滴定方法。 同样地，在专利申请WO 04/02179中，申请人描述了用于NCTA的体外滴定方法，使用了支持对应于前述NCTA的PrPsc的复制、并导致存在于待测生物物质中的PrPsc量增加的稳定转基因细胞株，以及使用这种滴定方法作为用于获得或处理可能被NCTA污染的生物制品的工艺方法的体外评估和/或控制方法的一部分、或作为用于设备去污染的工艺方法的体外评估和/或控制方法的一部分。该滴定方法能够计算可能被NCTA污染的生物制品的PrPsc的感染滴度。 本申请中的实施例A和B是参考实施例，回忆了专利申请WO04/02179中描述的滴定方法的可行性、及其用于评估纳滤步骤对PrPsc消除的效能。 至于适合于这些方法的感染性接种物的选择，选择极为有限。 迄今为止，使用的都是一个感染源含有感染的脑匀浆的感染性接种物。 在大多数情况下，这些匀浆从通过脑内接种感染物质而被感染的实验室动物、特别是啮齿动物中获得。 Miekka等公开了使用从用仓鼠263K瘙痒症蛋白作为25％白蛋白溶液的感染性接种物感染的仓鼠中获得的脑匀浆，来评估γ辐射关于仓鼠PrPsc失活同时保留人类白蛋白的完整性方面的效能。 使用从感染了新变种克雅病(vCJD)的对象获得的以及可从国立生物标准和控制研究所(National Institute for Biological Standard andControls，NIBSC)获得的标准脑和脾制品，也是可能的。它们含有10％的组织匀浆，被分成等量小份并保存。它们体现出作为人类来源的感染性物质的优势。 Stenland等(“在从人类血浆中纯化治疗性蛋白的过程中人类和绵羊形式的病原性朊病毒蛋白的分配”(″Partitioning of human andsheep forms of the pathogenic prion protein during the purification oftherapeutic proteins from human plasma″)，TRANSFUSION，Vol 42，2002年11月)通过多种人类血浆蛋白纯化步骤，在消除疾病方面，比较了从几个物种获得的、并且感染了不同疾病的多种脑匀浆。他们使用了下面的脑匀浆作为感染性接种物 -人类，感染了新变种克雅病(National CJD Surveillace Unit，爱丁堡，苏格兰) -人类，感染了散发性克雅病(NIH Laboratory of CNS Studies，Bethesda，MD) -人类，感染了GSS综合症(Gertsmann-Strussler-Scheinker)(New York State Institute for Basic Resea本文档来自技高网...

【技术保护点】
从表达朊病毒蛋白ＰｒＰ并支持所述ＰｒＰ的病原形式ＰｒＰｓｃ复制的稳定转基因细胞获得的细胞裂解液或培养上清液，其中ＰｒＰｓｃ感染滴度大于用所述ＰｒＰｓｃ感染的１０％动物脑匀浆的感染滴度的５０％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：让蒂埃里奥宾，布鲁诺尤，贝诺伊特弗兰，
申请(专利权)人：分馏及生物技术法国实验室，
类型：发明
国别省市：FR[法国]