用于个人识别的13个SNP位点多色荧光复合扩增试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于体外一次性多色荧光复合扩增具有较高个人识别能力的１３个ＳＮＰ基因座的试剂盒，是由分离包装的引物混合物、ＤＮＡ聚合酶、缓冲液、质控ＤＮＡ样品和等位基因分型标准物混合物构成。引物混合物由１３条荧光标记的共享引物和２６条针对不同等位基因的长度特异性引物组成。采用本试剂盒可以快速、准确获得１３个具有较高个人识别能力的ＳＮＰ位点的基因型，并通过自动荧光测序仪进行检测分型，达到高自动化水平。本发明专利技术的试剂盒用于法医学个人识别具有很大的优势和潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于个人识别的体外一次性复合扩增13个SNP基因座的试 剂盒，属于法医学个人识别领域的专利技术。
技术介绍
1996年美国的E. Lander首次提出了称之为"第三代遗传标记"的"单核 苷酸多态性"(single nucleotide polymorphism, SNP) 。 SNP是指在染色体 基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，而其中最少的一种等 位基因在群体中的频率不小于1%。它包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等 形式。SNP具有如下特点首先，SNP位点非常丰富。几乎分布于整个基因组， 基因组中大约平均每1000bp就会出现l个SNP，总数约有300万个。其次，SN P的突变率较低，每代每碱基突变率约为2 X 10—8。尤其是处于编码区的(cod ing region) SNP (又称cSNP ),是高度稳定的，而串联重复的微卫星位点的高 突变率使得对群体的遗传分析出现困难。第三，具有代表性。cSNP经常引起表 达蛋白的多态性变异，并进而影响他们的功能、特性。第四，扩增片断短，易 于符合扩增，易实现分析的自动化。第五，每个人均有独特的SNP图谱，SNP由 于其片段短、扩增效率高，对PCR的条件要求也相对较低，即使是法医学上常 见的细胞已经被破坏，DNA降解严重的腐败检材或是放置时间很长的检材，同样 可以用PCR技术扩增出特异的DNA片段来进行基因分型，就可以达到个人认定 的目的。SNP基因座的研究大多是逐个位点进行的，检测手段或者使用测序技术，或者釆用限制性内切酶消化的方法，前者技术复杂，费用昂贵；后者操作烦瑣、 准确性差。复合扩增(Multiplex PCR)又称为多重PCR，即在一个反应体系中 使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的过程。它 可大幅度地简化操作程序、节省时间和试剂，同时能满足同时分析不同基因位 点的需要。复合扩增(Mult i pl ex PCR)又称为多重PCR,即在一个反应体系中使 用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的过程。它可 大幅度地简化操作程序、节省时间和试剂。并且满足同时分析不同DNA序列的 需要，特别是在法医学鉴定中可以用极微量的检材同时扩增出多个遗传标志而 更显其优越性。基于检测体系的不同，目前世界上将复合扩增主要可以分为两大类硝酸 银染色复合扩增和荧光复合扩增。前者是复合扩增后的产物利用普通电泳槽分 离，进行硝酸银染色检测的方法。方法简单，成本较低，在普遍实验室可以开 展这个项目。但由于所得结果只是单种颜色，故其复合扩增试剂盒的位点数不 能太多， 一般1次复合扩增的位点不能超过4个，否则会因为不同位点的扩增 产物互相重叠，难以区分检材的基因型。再加上所得结果是用肉眼观察，所以 其灵敏度受到一定的限制。荧光复合扩增是在普通复合扩增PCR的其中一条引物一端加上荧光标记， 利用自动激光荧光遗传检测仪检测PCR扩增产物，结果准确、灵敏度高，自动 化程度高、可重复性强等。用一种颜色的荧光素标记一组3或4个基因位点(其 扩增片段不能相重叠)，另一种颜色的荧光素标记另一组3或4个基因位点，多 种荧光素则可以标记多组不同的基因位点。目前自动激光荧光遗传检测仪可以 检测几十种荧光素，但在一个反应体系中，最多可以同时检测5种荧光素，除其中一种用作内标外，其余四种荧光素可以用于标记产物，加在一起，就可以达到l次检测io个以上的基因位点的目的。荧光复合扩增已成为目前先进的复合扩增方法。
技术实现思路
本专利技术筛选了 13个在亚洲人群中具有较高多态性(其中最少的一种等位基 因在群体中的频率不小于30y。)的SNP基因座，根据引物特异性PCR的原理，每 个SNP基因座设计了 3条引物。在每一个SNP基因座侧面100-280bp范围内设 计了一条引物，作为该基因座的共享引物，并在引物5'末端选用一种荧光物质 标记;针对SNP基因座的不同等位基因，又设计了分别与SNP基因座不同等位基 因相匹配的两条引物，作为特异引物，引物3，末端的最后一个碱基分别与SNP 基因座不同等位基因的碱基匹配，但由于只有3'末端的最后一个碱基不匹配往 往不能抑制扩增，所以为了防止错误性扩增，3'末端第3或4位碱基人为引入 一个错配碱基，这是引物设计最为关键的部分；最后为了在检测时自动区分不 同的等位基因，设计引物时两条引物长度相差4bp (如果两条引物Tm值相差过 大，则人为引入TATA四个碱基，这是引物差异设计的另一个关键，因为TATA 对引物的退火温度影响最小，同时又满足了扩增片断长度不同的要求)，所有引 物长度1848bp，为了便于复合扩增，所有引物的Tm值保持在60士0.5。C，为 了减少引物之间的竟争抑制，对反应体系中不同SNP位点的引物浓度进行调整， 获得了最佳引物浓度配比，防止了非特异性扩增片断的产生。利用该试剂盒， 就能方便地同时对13个高个人识别能力的SNP基因座进行复合扩增，获得各基因座的基因型结果；同时，利用该试剂盒提供的等位基因分型标准物，利用基因分析软件(Genetyper2. 5.2)，还可以方便地自动检测、分析扩增结果。 附图说明图1为蓝色荧光标记物6-FAM的结构式；图2位黄色荧光标记物6-TAMRA(Tetramethyl-rhodamine)的结构式；图3为绿色荧光标记物JOE(6-carboxy画4，，5，-dichloro-2，，7，-dimethoxy-fluorescein)的结构式；图4为红色荧光标记物6-ROX(X-RHODAMINE)的结构式。 具体实施例方式本试剂盒由是由分离包装的13个SNP位点引物混合物、DNA聚合酶、反应缓冲液(含MgC12)、以及13个SNP位点等位基因分型标准物和质控DNA构成。13个SNP基因座的引物混合物2. 0ml(不同基因座引物浓度不相同，从30nM-240nM,每个20ul的复合PCR反应体系中用量为2ul ); DNA聚合酶1000u(5u/pl每个20ul的复合PCR反应体系中用量为lu);缓冲液2. Oml (IO倍浓缩缓冲液，每个20ul的复合PCR反应体系中用量为2ul);等位基因分型标准物混合物总量1 ml (40nM,供1000次检测使用)，等位基因分型标准物混合物中所含各个基因座的等位基因分型标准物等量；质控DNAO. lml (10ng/ul)。荧光复合扩增的技术核心主要在于引物序列与荧光标记的位置以及各种引 物的浓度配比。在本专利技术试剂盒中，13个SNP位点其参考序列均可通过NCBI查阅，13个SNP位点的名录为iVga/(Serl87Pr。) ， /L45^/^(Alal33Ser) ， Af5iM(Glu346Lys)， APD(Lys751Gln) ，A7 (X7(194Trp/Arg) ，AD尸及rO/76"/a) ， CT尸75J(Val432Leu)， OG(77(Ala85Ser)， /^EK/(Phe257Ser)， APC(Lys939Gln)， GS7M《T2517C)， ^A7iV2(Pro50Ser)， 尸丄O/(Thr706Ala)。13个高个人识别能力SNP位点引物序列为NQO1 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种１３个高个人识别能力ＳＮＰ位点多色荧光复合扩增试剂盒，该试剂盒包括ａ）引物混合物，ｂ）ＤＮＡ聚合酶，ｃ）缓冲液（含ＭｇＣｌ↓［２］），ｄ）质控ＤＮＡ，ｅ）等位基因分型标准物混合物，其特征是：引物混合物由１３条荧光标记共享引物和２６条针对不同等位基因的长度特异性引物组成；分别针对１３个肺癌易感性相关ＳＮＰ基因位点，分别为ＮＱＯ１（Ｓｅｒ１８７Ｐｒｏ），ＲＡＳＳＦ１（Ａｌａ１３３Ｓｅｒ），ＭＢＤ４（Ｇｌｕ３４６Ｌｙｓ），ＸＰＤ（Ｌｙｓ７５１Ｇｌｎ），ＸＲＣＣ１（１９４Ｔｒｐ／Ａｒｇ），ＡＤＰＲＴ（Ｖａｌ７６２Ａｌａ），ＣＹＰ１Ｂ１（Ｖａｌ４３２Ｌｅｕ），ＯＧＧ１（Ａｌａ８５Ｓｅｒ），ＲＥＶ１（Ｐｈｅ２５７Ｓｅｒ），ＸＰＣ（Ｌｙｓ９３９Ｇｌｎ），ＧＳＴＭ４（Ｔ２５１７Ｃ），ＡＸＩＮ２（Ｐｒｏ５０Ｓｅｒ），ＰＬＯＩ（Ｔｈｒ７０６Ａｌａ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞恒，
申请(专利权)人：辽宁师范大学，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]