基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法技术

基于ＥＬＩＳＡ法的免疫共沉淀试验方法，涉及生物技术，将免疫共沉淀法和酶联免疫吸附检测法结合起来，即，利用酶联免疫吸附检测法中的９６孔塑料板来捕获目的蛋白（蛋白质Ａ）－兴趣蛋白（蛋白质Ｂ）－抗兴趣蛋白抗体复合物，然后用抗兴趣蛋白抗体相对应的辣根过氧化物酶标记二抗，显色，酶标仪检测。本发明专利技术简化了实验过程，提高了检测系统的敏感度，具有稳定性和可重复性的特点，降低了实验成本，提高了实验效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术，特指一种基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，具体地讲指一种 快速、高通量、定量检测蛋白质与蛋白质间相互作用的免疫共沉淀-酶联试验技术，建立板式 固相免疫共沉淀-酶联试验的定量检测方法，用于快速筛查和定量检测共沉淀蛋白质。
技术介绍
目前，研究蛋白质间的相互作用有多种方法，常用的有酵母双杂交系统、免疫沉淀、 Pull-down等方法。其中，免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是相对稳定、简便的方 法，也是在蛋白质组的科学研究中的得到了广泛应用的一种方法，它是以抗体和抗原之间的 专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法，能够确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。但这种方法还有三个明显缺陷 一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是方法本身具有冒险性，必须在实验前预 测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果；三 是操作过程复杂，浪费较多的蛋白质样品，只能检测到纳克级(ng),所以灵敏度较低。另外， 与上述其他几种研究细胞内的蛋白质间相互作用的方法一样具有医学一些不足之处，如操作 程序复杂，技术操作要求高，所用耗材昂贵，费事、费时、重现性差等。这已经成为蛋白质 组研究进程的瓶颈，兹需一种能够快速、定量、高通量筛査蛋白质与蛋白质间相互作用的检 测方法。尽管也有学者对上述一些方法作了一些改进，或者专利技术了一些新的检测方法，依然存在耗 材昂贵，费事、费时、重现性差的不足之处，如意大利学者Persani等在《自然-临床实践 内分泌代谢杂志》上发表的题为"技术的洞察现代检测蛋白质与蛋白质相互作用的方法显 示有功能的促甲状腺素受体的聚合结构"(Persani L, Calebiro D, Bonomi M. Technology Insight: modern methods to monitor protein-protein interactions reveal functional TSH receptor oligomerization, Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2007，3(2):180-90.)文章中，总结了国外学者发 明的一些用于在活细胞内观察两种蛋白质的相互作用情况的现代检测方法，这些技术是基于 福斯特共振荧光能量转移的物理学检测方法。这些方法的优势是能够实时观察活细胞内的蛋 白质间的相互作用，但技术要求高，且设备昂贵。目前，最简单的研究两蛋白质相互作用的是酶联免疫吸附检测法(ELISA),在体外验证两 种蛋白质的相互作用，具有高通量、速度快、灵敏度高、重复性好、定量等优点。然而，该方法目前仅用于定量检测某一种蛋白质的含量，其优势未能充分发挥出来。本专利技术就是利用 了ELISA的原理及其上述优势来弥补免疫共沉淀的不足之处，发展了一个定量、快速、高通量检测蛋白质间的相互作用的方法。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提出一种新的技术方案，将免疫共沉淀法和酶联免疫吸附检测法结合起来，即，利用酶联免疫吸附检测法中的96孔塑料板来捕获目的蛋白(蛋白质A)—兴趣 蛋白(蛋白质B)—抗兴趣蛋白抗体复合物，然后用抗兴趣蛋白抗体相对应的辣根过氧化物酶 标记二抗，显色，酶标仪检测。本专利技术简化了实验过程，提高了检测系统的敏感度,具有稳定 性和可重复性的特点，降低了实验成本，提高了实验效率。本专利技术可通过下述技术方案实现的(1) 细胞内总蛋白的提取用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞，然后，在细胞中加入细胞裂解 液，将细胞离心，取上清液备用；(2) 用蛋白质A的抗体包被96孔塑料板选择与蛋白质A相应的抗体，抗体从商业公司订 购，用碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释抗体，稀释浓度为1 10pg/ml，再将稀释液加入到 %孔塑料板中进行包被，每孔加100 200pl， 37°C 2 6小时或4°C过夜；(3) 封闭用1 2wt。/。牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭余下的空白位点，37。C中孵育4 6小时；(4) 加样将步骤1中的上清液用磷酸盐缓冲液稀释，总蛋白浓度为1 10yg/ml，再将稀 释液加入到步骤2中已包被的塑料板的反应孔中，每孔加100 20(Hd，在37'C中孵育1 2 小时，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；(5) 加入与蛋白质B的一抗选择与蛋白质B相应的抗体，抗体从商业公司订购，磷酸盐缓 冲液稀释抗体，浓度为10 20 u g/ml，于各反应孔中，加入稀释的蛋白质B的抗体100 150nl， 37。C孵育0. 5 1小时，洗涤；(6) 于各反应孔中，加入与蛋白质B的抗体相应的辣根过氧化物酶标记二抗，37t:孵育0.5 l小时，洗涤；(7) 加底物液显色于各反应孔中加入显色底物溶液100 150nl， 37'C放置10 30分钟；(8) 终止反应于各反应孔中加入0. 1~0. 2mmo1硫酸。(9) 结果判定在酶标仪检测仪上，检测吸光度。步骤2中包被条件优选为每孔IO(HU， 4'C过夜；抗体的稀释浓度优选1. 25 y g/ml， 2. 5 u g /ml, g /ml， 10 w g/ml。步骤3中牛血清白蛋白(BSA)溶液优选2wt%，孵育时间优选6小时；步骤4中稀释的上清液中总蛋白浓度优选1^ig/ml，加入到96孔塑料板的体积优选为每孔 lO(Hil;孵育时间优选2小时；步骤5中抗体的稀释浓度优选10吗/ml，加入到96孔塑料板的体积优选为每孔100)^1，孵 育优选l小时；步骤6中孵育优选1小时；步骤7中底物液显色溶液为四甲基联苯胺(TMB)，加入到96孔塑料板的体积为每孔100 y 1, 反应时间为20分钟；步骤8中硫酸加入到96孔塑料板的量优选为每孔50 y 1。本专利技术是结合免疫共沉淀法和酶联免疫吸附检测法两种方法的原理，简化实验过程，提 高检测系统的敏感度，具有稳定性和可重复性的特点，降低了实验成本，提高了实验效率，且 可以对所需进行研究的蛋白质进行任意组合。提供一种快速、定量分析两种蛋白质与蛋白质 相互作用，高通量筛査一种蛋白质与其他蛋白质间的相互作用技术方案。具体优势可见列表。传统的免疫共沉淀法 基于ELISA法的免疫共沉淀<table>table see original document page 6</column></row><table>具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术作进一步阐述，但并不限制本专利技术范围。实施例 1.1细胞培养人脑胶质瘤细胞株U251购自中科院上海细胞与生化所，用含10。/。小牛血清(GIBCO) 的培养基(DMEM， GIBCO)培养液，37"5%0)2培养细胞，细胞长满后，以2Xl()5个/ml 浓度接种到24孔板中，每孔0.5ml。 37°C 5%032培养48小时后，细胞换用无血清培养基培 养细胞24小时,细胞换用含100ng神经生长因子(NGF) DMEM继续培养细胞1小时。1.2用免疫荧光双标技术确定磷酸化的酪氨酸激酶A (pTi:kA)和神经生长因子(NGF)在细 胞内的共定位。为了证明上述两种蛋白质在细胞内可能是相互作用的，本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于ＥＬＩＳＡ法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：　　　　按照下述步骤进行：　　　　（１）细胞内总蛋白的提取：用磷酸缓冲液洗涤细胞，然后，在细胞中加入细胞裂解液，将细胞离心，取上清液备用；　　　　（２）用蛋白质Ａ的抗体包被９６孔塑料板：选择与蛋白质Ａ相应的抗体，抗体从商业公司订购，用碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释抗体，稀释浓度为１～１０μｇ／ｍｌ，再将稀释液加入到９６孔塑料板中进行包被，每孔加１００～２００μｌ，３７℃　　２～６小时或４℃过夜；　　　　（３）封闭：用１～２ｗｔ％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）溶液封闭余下的空白位点，３７℃中孵育４～６小时；　　　　（４）加样：将步骤１中的上清液稀释，总蛋白浓度为１～１０μｇ／ｍｌ，再将稀释液加入到步骤２中已包被的塑料板的反应孔中，每孔加１００～２００μｌ，在３７℃中孵育１～２小时，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；　　　　（５）加入与蛋白质Ｂ的一抗：选择与蛋白质Ｂ相应的抗体，抗体从商业公司订购，磷酸盐缓冲液稀释抗体，浓度为１０～２０μｇ／ｍｌ，于各反应孔中，加入稀释的蛋白质Ｂ的抗体１００～１５０μｌ，３７℃孵育０．５～１小时，洗涤；　　　　（６）于各反应孔中，加入与蛋白质Ｂ的抗体相应的辣根过氧化物酶标记二抗，３７℃孵育０．５～１小时，洗涤；　　　　（７）加底物液显色：于各反应孔中加入显色底物溶液１００～１５０μｌ，３７℃放置１０～３０分钟；　　　　（８）终止反应：于各反应孔中加入０．１－０．２ｍｍｏｌ硫酸；　　　　（９）结果判定：在酶标仪检测仪上，检测吸光度。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚爱华，张志坚，孙湘兰，步雪峰，肖德生，杨勇，王穆兵，谷晓楚，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]