本发明专利技术提供了用于测定被圆环病毒感染的宿主动物宿主细胞培养物的病毒滴度的方法。本发明专利技术的基于ＦＡＣＳ的方法可以包括测定细胞培养基上清液中的宿主细胞和保持附着至固体支持物的那些细胞的存活力。检测和测量表达病毒抗原ＯＲＦ１和ＯＲＦ２的细胞百分比可以确定培养的宿主细胞的病毒载量。病毒产量可以通过检测和测量悬浮细胞中的两种抗原来确定，例如从宿主细胞转移至无血清培养基起５－７天。本发明专利技术的方法可以快速地产生定量数据。这允许在整个孵育过程中反复监控病毒生产并为选择最合适收获点作准备。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在批量孵育生产过程中使用荧光抗体细胞分选分析在 线(in-process)监控病毒产量的方法。本专利技术进一步涉及在可能缺 乏血清组分的培养基中在线监控并收获被圆环病毒感染的细胞培养物 的方法。
技术介绍
断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome) ( PMWS )是最近被识别的仔猪疾病。在加拿大、 美国和法国检测到的PMWS综合征的临床特征为体重逐渐减轻，以及体 征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疽。从病理学观点来看，其表现为淋 巴细胞或肉芽肿浸润，淋巴结病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉芽 肿性肾炎。(Clark E. G. ( 1997 ) Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 499—501; La Semaine Veterinaire No. 26， supplement to La Semaine Veterinaire 1996 (834) ; La Semaine Veterinaire 1997 (857):54; Nayar等人(1997 ) Can. Vet. J. 38:385-387 )。目前还没有 治疗和预防这种疾病的方法。然而，多项证据指出猪圆环病毒是PMWS 的病原体(Ellis等人(1998 ) Can. Vet. J. 39:44-51 )。圆环病 毒已从患有PMWS的猪回收，并且针对猪圆环病毒的抗体已在患有该疾 病的猪体内证实。命名为圆环病毒科的病毒科在一系列植物和动物种类中发现并且 通常被称为圆环病毒，其特征为包含环状单链脱氧核糖核酸(ssDNA) 的圆形无包膜的病毒粒子，平均直径为17-23. 5nm。圆环病毒的ssDNA 基因组代表已知的最小的病毒DM复制子。如WO 99/45956中公开的， 依据国际病毒分类委员会笫6次报告，至少6种病毒已鉴定为该科成 员(Lukert等人，1995， The Circoviridae，第166-168页。InMurphy 等人，(eds. ) Virus Taxonomy, Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Arch. Virol. 10 Suppl.)。该科中包括的动物病毒是鸡贫血病毒(CAV );味羽病病毒(BFDV ); 猪圆环病毒(PCV);和鸽圆环病毒。PCV最初从猪肾细胞培养物中分 离。PCV在细胞核中复制并产生大的核内包含体。参见Murphy等人 (1999， Circoviridae第357-361页，Veterinary Virology,第3 版，Academic Press, SanDiego)。目前识另'J 了 2种类型的PCV - PCV 1型(PCV1 )和PCV 2型(PCV2 )。作为连续猪肾细胞系PK-15 ( ATCC CCL31)的持续污染物被分离出的PCV1,在细胞培养物中不会引起可 检测细胞病变效应，并且在实验性感染后在猪中未能产生临床疾病(参 见Allan G. ( 1995 )Vet. Microbiol 44: 49-64; Tischer等人(1982 ) Nature 295: 64-66 ; 和 Tischer 等人(1986 ) Arch. Virol 91:271-276 )。只在最近， 一些作者认为PCV毒林能够致病且与PMWS综合征有 关(Nayar等人(1997 ) Can. Vet. J. 38: 385-387和Clark E. G. (1997 ) Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 499-501 ) 。 Nayar等人用 PCR技术在患有PMWS综合征的猪中已检测到PCV DM。和PCV1相反， PCV2与断奶猪中的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)紧密相关(参见Allan等人(1998 ) Eur. J. Vet. Diagn. Investig. 10:3-10; Ellis等人(1998 )Can. Vet. J. 39: 44-51和Morozov等人(1998 )' J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 )。关于PCV1的核苷酸序列在Mankertz等人(1997 ) J. Virol. 71:2562-2566 )和Meehan等人(1997 ) J. Gen. Virol. 78:221-227 ) 中公开，并且关于PCV2的核苷酸序列在Hamel等人(1998 ) J. Virol. 72: 5262-5267; Mankertz等人(2000 )Virus Res. 66: 65-77和Meehan 等人(1998 )J. Gen. Virol. 79: 2171-2179中公开。PCV2毒抹在W0 00/01409中公开且已保藏在英国Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG应用微生物学研究中心(Centre for Applied Microbiology & Research)的欧洲细胞培养物保藏中心，并且包括登记号 V97100219;登记号V9700218;登记号V97100217;登记号V98011608; 和登记号V98011609。 WO 00/77216同样7^开了 PCV2。在PCV2基因组中已鉴定了多达13个可读框(M尸)。Meehan 等人，(1998 ))也称为M尸《包含核苷酸398-1342 ( GenBank登记 号AF055392 )并且可能编码预测分子量为37.7 kD的蛋白质。^ F2 (Meehan等人，(1998 ));也称为朋尸7J,包含与1-314相连的核 苷酸1381-1768 (GenBank登记号AF055392 ),且可以编码预测分子 量为27.8 kD的蛋白质。PCV2 ORFs 1-13的进一步描述可以在美国专 利号6, 368, 601 、 6,391,314、 6， 660272、 6, 217, 883、 6, 517, 843、 6， 497, 883以及AU 764379、 EP 1019510、 MX 221562、 MX 216996、 RU 2237492和NZ 505008中找到，所述专利全文引入本文作为参考。PCV2的与PCV1分离林的高度相似(86%同一性) (Meehan等人，(1998 ) ) 。 PCV1的0RF1蛋白质已部分表征(Meehan 等人，1997; Mankertz等人，(1998 ) Virus genes 16:267-276 ) 并且已显示是病毒复制所必需的，很可能涉及病毒DNA复制。其0RF2s之间的蛋白质序列同一性(66%同一性)低于0RF1之间 的同一性，但是每个0RF2具有高度保守的碱性N-末端区，类似于在 禽类圆环病毒鸡贫血病毒(CAV) (Meehan等人，1998)的主要结构蛋白质的N-末端区所观察到的那种。最近，Mankertz等人，在(1998 ) J. Gen. Virol. 79本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于荧光抗体细胞分选（ＦＡＣＳ）的用于检测被病毒感染的宿主细胞培养物的圆环病毒抗原生产的方法，其中所述圆环病毒抗原的生产与可读框１（ＯＲＦ１）和可读框２（ＯＲＦ２）阳性细胞百分比相关，其包括： 从来自被圆环病毒感染的宿主细胞培养物的、包含非贴壁宿主细胞群和附着至基质的宿主细胞群的样品中分离（ｉ）非贴壁宿主细胞和（ｉｉ）脱离基质的贴壁宿主细胞，和 测定在所述分离的非贴壁宿主细胞和所述脱离基质的贴壁宿主细胞中存在的（ｉ）可读框１（ＯＲＦ１）阳性细胞的百分比和（ｉｉ）可读框２（ＯＲＦ２）阳性细胞的百分比。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：P埃利伯特，LP丘皮尔拉德，J雷耶斯，
申请(专利权)人：梅瑞尔有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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