本发明专利技术公开了人乳转铁蛋白ＬＴＦ及其ＥＬＩＳＡ检测试剂盒在鼻咽癌诊断中的应用。本发明专利技术通过研究证实人乳转铁蛋白ＬＴＦ基因在鼻咽癌组织中特异表达下调，从而提出乳转铁蛋白ＬＴＦ用于鼻咽癌诊断、筛查和患病风险预测的用途。并制备出抗人ＬＴＦ的抗体，进一步经双抗夹心法制备出用于鼻咽癌诊断的ＬＴＦ蛋白ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，从鼻咽部取分泌物进行ＥＬＩＳＡ检测，可以定量检测各人群鼻咽分泌物中ＬＴＦ蛋白表达量，从而预测鼻咽癌的患病风险，筛查易感者，并对鼻咽癌患者做出早期、快速的无创性诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及乳转铁蛋白在鼻咽癌早期诊断中的应用以及一种用于鼻咽癌 早期诊断的乳转铁蛋白检测试剂盒。技术背景鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是我国南方常见的恶性肿瘤，为 鼻咽粘膜上皮发生的癌肿，大多数为低分化鳞状细胞癌，其恶性程度高，发 病部位隐蔽，特别是在咽隐窝和鼻咽顶部者，早期症状不明显，因而难以早 期发现，误诊误治率较高。鼻咽癌的五年生存率近年来一直徘徊在50~60%左 右，而鼻咽癌早期确诊病人五年生存率可达90%以上，因此对鼻咽癌进行高 危人群筛查和早期诊断，以便进行早期治疗，可显著提高患者生存率，这一 直是NPC临床研究的重要课题。目前鼻咽癌的早期检测方法有多种，包括EB病毒血清学标记物、鼻咽癌 相关肿瘤标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子以及端粒酶 等的检测。虽然这些指标的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了有用的信 息，但它们均缺乏足够的灵敏度和特异性。比如EB病毒不但与鼻咽癌的发生 有关，而且与Burkitt淋巴瘤、上呼吸道的感染等密切相关，近来也有报导在 各种T细胞淋巴瘤中检测到EB病毒DNA，而且并非所有鼻咽癌的发生均与 EB病毒相关，90X以上的人群在成年前都感染过EBV，在NPC患者血清中 检测到EBV也并不能证明EBV直接与NPC有关，鼻咽癌患者EB病毒抗体 与病理诊断相比阳性符合率仅为72.6%~77.3%。因此，虽然EB病毒相关抗体 滴度与鼻咽癌的发生发展有很高的相关性，其检测方法也有优越性，但仍然 只能作为一种相关指标而起提示作用，不能用来作为鼻咽癌的确诊指标。如 果缺少病理诊断，即使EB病毒相关抗体滴度再高，也难以作为实施放疗和化 疗的依据。除了对晚期鼻咽癌的病理诊断外，目前尚没有其他的早期、无创 性检查方法；即使是病理性诊断，也难以一次性取到病变组织，无法避免对 微小病灶的多次有创性取样。鼻咽癌非典型病灶型或粘膜下型的病例虽经多 次活检，常因无病理切片阳性结果而延误治疗；对于放疗后的病例，当其鼻 咽癌组织表现不典型时，在判断其病变是复发还是放疗反应上，也左右为难，尤其是某些放疗后出现颅脑症状的患者，各项检查(包括病理检查)都很难准确 判断到底是放射性脑病还是病灶向颅内发展，极大的影响治疗决策。因此， 如果能建立一种能对鼻咽癌患者进行筛查、诊断的无创性检査方法，则对鼻 咽癌的早期筛查、诊断、预防及治疗均具有极其重大的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过研究证实人乳转铁蛋白LTF基因在鼻咽癌组织中 特异表达下调，从而提出乳转铁蛋白LTF可用于鼻咽癌诊断、筛查和患病风 险预测的用途。本专利技术的另一的在于提出人乳转铁蛋白ELISA检测试剂盒在鼻咽癌的 早期诊断、筛查和患病风险预测的应用，以解决目前对鼻咽癌没有灵敏有效 的早期、无创性检査方法的问题。经过多年的研究，专利技术人发现鼻咽癌特异表达下调基因LTF (lactotransferrin，基因存取号NM—002343; GI:54607119),并证明该基因编 码一种分泌性蛋白，能在正常人鼻咽分泌物中检测出，但在鼻咽癌患者鼻咽 分泌物中表达下调或缺失。专利技术人通过对经显微切割纯化的人正常鼻咽粘膜 上皮和各个临床分期的鼻咽癌活检组织，进行全基因组基因表达谱分析，发 现人乳转铁蛋白基因是在正常鼻咽上皮和鼻咽癌组织中表达差异最明显的基 因(p〈9.28X10—11)。经组织微阵列大样本验证，发现所有的正常鼻咽部腺体均 能检测到LTF蛋白的存在，证实LTF蛋白在鼻咽部高表达、且为细胞分泌性 蛋白，但不论在mRNA水平或者蛋白水平，LTF的表达在鼻咽癌活检标本或 病理切片中均显著下调或缺失。此外，LTF蛋白的表达与鼻咽癌临床分期存 在显著相关性(p <0.01)，临床I期和II期鼻咽癌中LTF蛋白的表达明显高于 临床in和IV期。另外LTF还与鼻咽癌转移呈负相关(p〈0.05)，提示LTF它与 鼻咽癌的侵袭转移和临床进展有关，可作为鼻咽癌侵袭、转移和临床进展预 测的分子靶标。专利技术人进一步的研究表明，正常人群的鼻咽分泌物中LTF蛋 白浓度大约为30~165ug/ml，而鼻咽癌患者的鼻咽分泌物中LTF蛋白浓度小于 10ug/ml。专利技术人在上述研究基础上，制备了抗人LTF的抗体，进一步经双抗夹心 法制备LTF蛋白的ELISA检测试剂盒。本专利技术用于鼻咽癌早期诊断的人乳转 铁蛋白ELISA检测剂盒包括兔抗人LTF多抗包被好的酶标板，鼠抗人LTF 多肽单抗，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记二抗，通用试剂 Tween—20和显色底物如邻苯二胺(ortho-phenylenediamine-Hcl， OPD)等。该试剂盒的酶标板孔内为经包被液处理和阻滞液处理的兔抗人LTF融合蛋白抗 体；试剂盒酶标板孔内LTF融合蛋白抗体的浓度以2ug/ml最为合适。用本专利技术制备的LTF蛋白的ELISA检测试剂盒，从鼻咽部取分泌物进行 ELISA检测，可以定量检测各人群鼻咽分泌物中LTF蛋白表达量，从而预测 鼻咽癌的患病风险，筛査易感者，并对鼻咽癌患者做出早期、快速的无创性 诊断。研究结果表明该试剂盒能检测出0.01ug/mlLTF蛋白的浓度，这说明 本专利技术的试剂盒具有较高的灵敏度；该试剂盒对门诊初诊病人的诊断与病理 结果一致，且检测快速，对被检者不造成损伤，病人及正常人均可接受。因 而，该试剂盒不但可用于鼻咽癌的早期诊断，而且适用于鼻咽癌的早期大规 模人群筛査与患病风险预测，为鼻咽癌的早期诊断与防治提供了强有力的技 术支持，具有极大的经济与社会价值。另外专利技术人还发现LTF的表达量和鼻 咽癌患者的临床分期及转移密切相关，因此，本专利技术的ELISA检测试剂盒还 可作为鼻咽癌预后预测的指标。附图说明图1:免疫组织化学方法检测LTF在正常鼻咽上皮标本中的表达结果图； 图2:免疫组织化学方法检测LTF在鼻咽癌活检标本中的表达结果图； 图3: Western Blot检测LTF在正常鼻咽分泌物和鼻咽癌患者鼻咽分泌物 中的表达结果；图4:对本专利技术试剂盒特异性检测的结果。具体实施方式前期研究中，专利技术人利用18个湖南鼻咽癌高发家系，通过连锁分析，首 次发现染色体3p21部分区域与鼻咽癌发病紧密连锁，经单倍型分析和精细定 位，将鼻咽癌易感基因区域定位于微卫星标记D3S1289-D3S1298之间。此结 果提示染色体3p21区域可能存在鼻咽癌的候选易感基因。为了筛査与鉴定染色体3p21区域鼻咽癌的候选易感基因，专利技术人制备了 两种不同的基因芯片， 一种是基于鼻咽癌抑制消减杂交文库的cDNA MicroArray，另一种是包含染色体3p21区域(D3S1289-D3S1298) 288个基 因的专制芯片。为提高芯片筛查结果的可靠性，用两种不同的基因芯片对相 同的试验样本进行研究。首先，以4个鼻咽癌相关的抑制消减杂交文库(NNTDH12、 TRP19 DHNE1、 TNPC DNN119和TNN119 DNPC)为模板，利用PCR技术扩增点 制cDNA芯片所需的克隆，每个文库约300个、总共1200余个克隆，克隆纯化后点制基于鼻咽癌抑制消减杂交文库的cDNAMicroArray。10例本文档来自技高网...
【技术保护点】
人乳转铁蛋白在鼻咽癌诊断中的用途，其特征在于所述应用方法为：取待测鼻咽分泌物，检测鼻咽分泌物中ＬＴＦ蛋白浓度，当鼻咽分泌物中ＬＴＦ蛋白浓度小于１０ｕｇ／ｍｌ时判断为鼻咽癌阳性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李桂源，熊炜，曾朝阳，周艳宏，张文玲，李小玲，周厚德，范松青，肖岚，周鸣，沈守荣，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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