氯丙嗪的酶联免疫试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及兽药残留检测分析技术领域中一种检测氯丙嗪的酶联免疫试剂盒及其检测方法。氯丙嗪的酶联免疫试剂盒，包括氯丙嗪标准溶液、显色剂、浓缩洗涤液、终止液、样品稀释液。另外，还包括氯丙嗪特异性抗体、包被有氯丙嗪特异性抗体的酶标板和酶标记物；所述酶标记物为酶标记氯丙嗪抗原。本发明专利技术的检测氯丙嗪的酶联免疫试剂盒对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，将在氯丙嗪残留的检测中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽药残留检测分析
中一种检测氯丙嗪的酶联 免疫试剂盒及其检测方法。技术背景氯丙嗪系吩噻嗪类代表药物，为中枢多巴胺受体的阻断剂，具有 抗精神病、镇吐、降温和增强催眠麻醉等多种药理活性。在动物饲料 和运输过程中使用可降低动物的维持需要和减少途中失重、死亡率。 近几年来，有些饲料企业为了追求词料的转化率和高额利润，在饲料中随意添加镇静、催眠类违禁药物，在动物组织中残留导致畜产品的不安全。2002年下半年全国饲料和词料添加剂质量监督抽査结果中， 共有258批次样品检出了违禁药物和违规添加药物，其中安定120批 次占全部1650批次不合格样品的7.2%。为此国家有关部门也下文将 安定类明确定为禁用药物之一。为了打击非法使用违禁药物，保护消 费者的健康安全，我们除了健全法律法规，建立有效的监督管理体系 外，还需要健全相应的检测方法。因此，建立快速、灵敏、有效的氯 丙嗪、地西泮残留检测方法具有重要的意义。目前氯丙嗪的检测技术主要有色谱技术。色谱技术为经典技术， 主要有高压液相色谱(HPLC)，高压液相色谱/荧光(HPLC/FLD)，液相色 谱-质谱连用(LC-MS)，气相色谱-质谱连用(GC-MS)，毛细管电泳等方 法。这些方法灵敏准确，但是样品处理烦琐费时，成本高，而且需要 有经过专门训练的专业人员来操作复杂的仪器设备。因此，很有必要研究更加简单快捷方便的检测方法。
技术实现思路
为了解决上述色谱技术样品处理烦琐费时，成本高，操作复杂的 技术缺陷。本专利技术的一个目的是提供一种具有高特异性、高灵敏度、 高精确度、高准确度氯丙嗪的酶联免疫试剂盒。本专利技术的另外一个目 的是提供一种氯丙嗪检测方法。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案-氯丙嗪的酶联免疫试剂盒，包括氯丙嗪标准溶液、显色剂、浓縮 洗涤液、终止液、样品稀释液。另外，还包括氯丙嗪特异性抗体、包 被有氯丙嗪特异性抗体的酶标板和酶标记物；所述酶标记物为酶标记 氯丙嗪抗原。作为优选，上述的氯丙嗪特异性抗体为氯丙嗪多克隆抗体。作为 再优选，上述的氯丙嗪多克隆抗体为氯丙嗪兔多克隆抗体。作为优选，制备氯丙嗪兔多克隆抗体的氯丙嗪免疫抗原为用氯丙 嗪与载体蛋白通过碳化二亚胺法合成的偶联物。作为再优选，上述的 载体蛋白可为鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、甲状腺蛋白、兔血清蛋白、 人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。作为最优选，以氯丙嗪-BSA作 为免疫抗原制备氯丙嗪多克隆抗体。作为优选，上述的酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷 酸酯酶。作为最优选，酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶。制备酶 标板所需试剂为包被缓冲液pH9. 6，0. 05mol/L 的碳酸盐缓冲液 (CBS) :2. 93gNaHC03， 1. 59gNa2C03，加蒸馏水定容至lOOOmL;封闭液含有3%的聚乙二醇8000， 1%的酪蛋白，4%的甘氨酸，1% 的卵清蛋白，1%的明胶的溶液。作为优选，上述的样品稀释液为含有P/。BSApH7. 4， 0. Olmol/L的 磷酸盐缓冲液(PBS):8.OOgNaCl ，0.2gKCl ，0. 2gKH2P04 ， 3.58gNa2HP04* 12H20，溶于蒸馏水中，用NaOH或HC1调pH至!j 7. 4，定 容至lOOOmL;所述浓縮洗涤液为含有0. 5%吐温pH7. 4, 0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS);所述显色剂为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为l-2mol/L的硫酸、盐酸或氢氧化钠缓冲液。所述氯丙嗪标准品溶 液为含有氯丙嗪七个浓度梯度的溶液，用上述样品稀释液稀释。为了实现上述的第二个目的，本专利技术采用了以下的技术方案氯丙嗪的检测方法。当被检样品为尿液，直接采用上述任意一种 技术方案所述的氯丙嗪的酶联免疫试剂盒检测。当被检样品为动物组织，用均质器均质样本，称取O. 5 2g匀浆 的动物组织样品，加入2 10mLl%NaOH的甲醇溶液，置旋涡混合器上 混合O. 5 2min，静置5 20min; 2000 500g离心3 10min;取上清 液，50 7(TC氮吹干，残渣用1 2ml样品稀释液稀释，振荡器上振摇 充分溶解，即采用如上述任意一种技术方案所述的氯丙嗪的酶联免疫 试剂盒检测。本专利技术的试剂盒可定性、定量检测动物源食品样品中动物组织(肌 肉、肝脏)中的氯丙嗪含量。本专利技术的方法中，酶标板的微孔中包被 有氯丙嗪特异性抗体，加入样品溶液或标准品溶液及酶标记氯丙嗪抗 原，样本中残留物氯丙嗪将和酶标抗原竞争抗氯丙嗪抗体，显色；显 色终止后用酶标仪测定吸光度值(0D值)，样品吸光度值与其所含残留物氯丙嗪的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中残留的 氯丙嗪含量。同时根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的氯 丙嗪的标准液颜色的比较可判断样品中氯丙嗪的浓度范围。本专利技术的检测氯丙嗪的酶联免疫试剂盒对样品的前处理要求低， 样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。经过对试剂盒的精 密度和准确度测试实验表明，本专利技术的酶联免疫试剂盒具有高特异性、 高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，将在氯丙嗪残留的检测中发 挥重要作用。本专利技术的试剂盒结构简单、使用方便、价格便宜、便于 携带，可实现现场监控及大量的样本筛査。本专利技术的检测氯丙嗪的方 法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。本发 明简化了传统检测方法的步骤，縮短了检测的时间，具有可观的社会 效益和经济效益。 附图说明图1为本专利技术的酶联免疫试剂盒氯丙嗪标准曲线图。具体实施方式下述实施例的方法如无特别说明，均为常规方法。 l.抗原的制备取40mg载体蛋白溶于lmL的水中，取氯丙嗪半抗原10mg，碳化 二亚胺30mg，溶于lmL水中，混合液逐滴加到载体蛋白溶液中，在20-25 。C下，搅拌反应过夜，再次加入15mg碳化二亚胺，后放于4'C冰箱内 24-28h，反应完成后将反应液装入透析袋，4"C下，pH=7.4的PBS中 透析，分装，-2(TC保存；以氯丙嗪-BSA作为免疫抗原。2.多克隆抗体的制备免疫兔子免疫动物选用新西兰大白兔，免疫前耳缘静脉取血5-10mL，作为 阴性血清对照。初免将0.5mg的免疫抗原与等量弗氏完全佐剂混合， 完全乳化后，采用背部皮下多点注射；三周后用取相同剂量免疫原与 弗氏不完全佐剂混合后同法进行加强免疫；以后每两周加强免疫一次， 共免疫6次后，血清效价达到很高时，最后一次加强免疫，4天后颈 动脉采全血。 抗血清处理采全血后，3000rpm离心20min，取出上层抗血清。获得的抗血清 分成三部分保存一部分与等量甘油混合后保存， 一部分用饱和硫酸铵 法纯化提取IgG并冷冻干燥后保存，另一部分直接分装后保存。三部 分血清均保存在-2(TC冰箱内。 饱和硫酸铵法纯化抗血清将5mL抗血清与等体积的生理盐水混合后，边搅拌边逐滴加入 10mL的饱和硫酸铵。4。C冰箱静置过夜。第二天，4。C,4000rpm离心 20min，弃上清。沉淀用少量生理盐水重新溶解后，加生理盐水恢复至 10mL，然后边轻轻搅拌边逐滴加入5mL饱和硫酸铵溶液，4"C冰箱静置 过夜。4°C， 4000rpm离心20min，弃上清，沉淀用饱和硫酸铵重复提取 一次。最后获本文档来自技高网...

【技术保护点】
氯丙嗪的酶联免疫试剂盒，包括氯丙嗪标准溶液、显色剂、浓缩洗涤液、终止液、样品稀释液，其特征在于：还包括氯丙嗪特异性抗体、包被有氯丙嗪特异性抗体的酶标板和酶标记物；所述酶标记物为酶标记氯丙嗪抗原。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张明洲，王旻子，刘军，陈宗伦，胡华军，傅小伟，程晔，魏建良，
申请(专利权)人：中国计量学院，杭州迪恩科技有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]