本发明专利技术涉及一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，包括１）：底物＋草酸脱羧酶＋醋酸缓冲溶液，３０－３７℃，反应０．５－１ｈ；２）配制ｐＨ７．３～８．５的含磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、ＮＡＤＨ、苹果酸脱氢酶的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液，３０－３７℃，温育，３８０ｎｍ处测Ａ↓［１］；３）在步骤２）中添加步骤１）反应液，３０－３７℃反应，３８０ｎｍ处测Ａ↓［２］；４）根据ΔＡ↓［３８０ｎｍ］＝Ａ↓［１］－Ａ↓［２］计算ＮＡＤＨ减少量，再根据反应原理计算生成二氧化碳的浓度，从而计算草酸脱羧酶的活力。本方法可靠，灵敏度高，与测定草酸脱羧酶的经典方法所测值相近，是一种很好的测定草酸脱羧酶酶活的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于草酸脱羧酶活力的测定方法，特别是涉及一种通过测定酶反应产物二氧化 碳浓度来确定草酸脱羧酶活力的方法。技术背景目前草酸脱羧酶活力的测定方法主要有HPLC法、分光光度法、测压法等。酶的活性 可以通过测定底物草酸分解产生的甲酸的量、二氧化碳的量或者草酸分解减少的量得到。 甲酸的测定可以用HPLC或甲酸脱氢酶法，二氧化碳的测定可以通过测压计测定，草酸的 测定可以通过HPLC或草酸氧化酶法测定。HPLC方法主要是对仪器和样品的要求比较高，不利于推广；酶法测定中的草酸氧化酶因为产率较低，售价昂贵，也不利于进一步推广。 1980年Beutler等人以草酸为底物，加入氧化型辅酶I (NAD+)以及甲酸脱氢酶，用 紫外分光光度法在340 nm处测定其吸光值从而得到甲酸的量。经过许多学者的改进，现 在的经典方法如下具体所述(1) 在0.3 mL 0.2 M醋酸缓冲液(pH 5.6)中加入0.1 mL 50 mM的草酸溶液和0.1 mL (v)的草酸脱羧酶液，反应液最终pH为3.0， 37'C条件下反应30min (T);(2) 然后加入2mL氧化型辅酶I和0.3mL的去离子水，继续在3(TC下反应2 min，终止 酶促反应，用紫外-可见光分光光度计在340 nm处测定反应液的吸光值A1;(3) 再加入0.2mL的甲酸脱氢酶(约5.27U/mL)，反应液最终体积(V)为3 mL，在同 样的温度下，反应30min，在340nm处测定反应液的吸光值A2，得厶八=八2-八1;(4) 按照公式(2)计算草酸脱羧酶的酶活， 一个酶活单位定义为在30°C pH3.0， 一个大 气压下，每分钟生成1 pmol甲酸的量。体积酶活单位为U/mL。V乂 AA体积酶活(U/mL)= VXAA340mn 公式(2)e2 x d x T x vV——最终体积(mL) T——反应时间 (min) v ——待测粗酶液体积(mL) d ——光路直径(cm)s2——NADH在340nm处的吸收系数(6.3 L'mmol"'cm")这种方法简便、精确度高，是目前测定草酸脱羧酶的经典方法。但这种方法存在耗时 长、成本高的缺点，如第二步添加甲酸脱氢酶后的酶反应时间需要半小时，较耗费时间；所用的甲酸脱氢酶由于产量低等原因，价格昂贵，使测定草酸脱羧酶活力的成本大大增加。 因此大家都在寻找一种能替代这种经典方法，且耗时短、价格较便宜、精确度与该方法相 近的测定草酸脱羧酶活力的方法。由草酸脱羧酶的催化反应可以知道该酶活性也可以通过测定其反应产物二氧化碳的 量来得到。二氧化碳的测定可以利用测压计法和酶法。测压计法繁琐，且对仪器要求高， 而酶法是一发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，该法 通过测定酶反应产物二氧化碳的浓度的变化得到草酸脱羧酶活力，这种测定方法与经典方 法相比，精确度相近，耗时短，价格相对便宜，有很好的实用性。本专利技术的一种，包括步骤 (2)第一步酶催化反应体系——草酸脱羧酶催化降解草酸生成甲酸和二氧化碳空白组混合0.3 mL200 mM醋酸缓冲液、0.1 mL 50 mM草酸和0.1 mL处理失活(沸 水浴15 min-20 min)的草酸脱羧酶酶液待测样品组混合0.3 mL200 mM醋酸缓冲液、0.1 mL50 mM草酸和O.lmL待测草酸 脱羧酶酶液底物(v)第一步酶催化反应体系总体积(V2)为0.5 mL，反应pH为3.0~3.7，反应温度为30~37 °C，反应时间(T)为30-60 min;(2) 第二反应体系空白组和待测样品组都为1.0mLCO2试剂，其CO2试剂的组成为8.0mM磷酸烯醇 式丙酮酸、1.6 mM还原型辅酶I (NADH)、 1000-1200 U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和 200-300 U/L的苹果酸脱氢酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.3~8.5);第二反应体系在30 37。C温育5~10 min， 380 nm条件下测定A1;(3) 第三反应体系空白组混合1.0mLCO2试剂和0.01 0.1 mL上述第一步酶反应空白组液(V3) 待测样品组混合1.0 mL C02试剂和0.01~0.1mL上述第一步酶反应待测样品组液(V3) 第三反应体系总体积(Vi)为lmL+V3， 30~37°C， 5 10min， pH7.3~8.5， 380 nm下测定A2，计算AA:A广A2;(4) 计算草酸脱羧酶活力(U/mL)一个酶活单位定义为在30 37'C， pH 3.0-3.7， 一个大气压下，每分钟生成1 pmol二氧化碳的量。体积酶活定义为每mL草酸脱羧酶酶液中的酶活力单位数，体积酶活单位 为U/mL。体积酶活(U/mL) = VlXAA380nmXV2 公式(1)qxdxTxvxVs其中，AA380nm=AA样品—△ A空白——最后的反应液总体积(mL) T——第一步草酸脱羧酶反应时间(min) v——待测酶液样品体积(mL) V2——第一步酶反应液总体积(mL) V3——参加第三步反应的酶反应液体积(mL) d——比色皿光路直径(cm)f i——NADH在380 nm处的吸收系数(1.33 L'mmorLcm-1)本方法通过分光光度在380 nm波长下检测NADH浓度的变化计算二氧化碳的浓度， 从而计算草酸脱羧酶的酶活力，第三步反应中加入的第一步酶反应液的体积可以随待测样 品酶活力的变化而改变。本专利技术的测定原理是采用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化碳酸氢盐和烯醇式丙 酮酸反应，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸在苹果酸脱氢酶(MDH)的催化下还原成苹果 酸，同时还原型辅酶I(NADH)被氧化成NAD,通过在380 nm波长出测定吸光度的变化值， 即可测得样品中二氧化碳的浓度，进而计算草酸脱羧酶活力(见图l)。 本专利技术的有益效果(1) 利用烯醇式丙酮酸和苹果酸脱氢酶系测定二氧化碳浓度，较简便，相对縮短了第二 步的反应时间(5min，甲酸脱氢酶方法需要30min);(2) 价格相对经典方法便宜几十倍，精确度与经典方法相近。 附图说明图1是测定草酸脱羧酶活力的原理和步骤简图；图2是本方法与经典方法测定结果的比较，图中显示本方法结果与经典方法结果相近，精 确度较高，每组结果均为三次测量值的平均值。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。实施例1按照下表l，进行实验。表1反应试剂空白待测样品反应条件200 mM醋酸0.30.3缓冲液(mL)50 mM草酸 (mL)0.10.1第一步酶催化反应体系总体积(V2)为0.5待测草酸脱羧 酶酶液(mL)(v)0.1mL，反应pH为3.0，反应温度为3(TC， 反应时间(T)为30min草酸脱羧酶酶液(处理失0.1活)(mL)C02试剂1.01.037。C温育5 min， pH 8.0， 380 nm条件下(mL)测定Ai上述第一步酶反应体系3总体积(V。为1.05 mL， 37反应液(mL)，0.050.05。C， 5min, p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，包括步骤：（１）第一步酶催化反应体系空白组：混合０．３ｍＬ２００ｍＭ醋酸缓冲液、０．１ｍＬ５０ｍＭ草酸和０．１ｍＬ处理失活的草酸脱羧酶酶液待测样品组：混合０．３ｍＬ２００ｍＭ醋酸缓冲液、０．１ｍＬ５０ｍＭ草酸和０．１ｍＬ待测草酸脱羧酶酶液ν第一步酶催化反应体系总体积Ｖ↓［２］为０．５ｍＬ，反应ｐＨ为３．０～３．７，反应温度为３０～３７℃，反应时间Ｔ为３０～６０ｍｉｎ；（２）第二反应体系空白组和待测样品组都为：１．０ｍＬＣＯ↓［２］试剂其ＣＯ↓［２］试剂的组成为８．０ｍＭ磷酸烯醇式丙酮酸、１．６ｍＭＮＡＤＨ、１０００－１２００Ｕ／Ｌ磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和２００－３００Ｕ／Ｌ的苹果酸脱氢酶的ｐＨ７．３～８．５Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液；第二反应体系在３０～３７℃温育５～１０ｍｉｎ，３８０ｎｍ条件下测定Ａ↓［１］；（３）第三反应体系空白组：混合１．０ｍＬＣＯ↓［２］试剂和０．０１～０．１ｍＬ上述第一步酶反应空白组液Ｖ↓［３］待测样品组：混合１．０ｍＬＣＯ↓［２］试剂和０．０１～０．１ｍＬ上述第一步酶反应待测样品组液Ｖ↓［３］第三反应体系总体积Ｖ↓［１］为１ｍＬ＋Ｖ↓［３］，３０～３７℃，５～１０ｍｉｎ，ｐＨ７．３～８．５，３８０ｎｍ下测定Ａ↓［２］，计算ΔＡ＝Ａ↓［１］－Ａ↓［２］；（４）计算草酸脱羧酶活力Ｕ／ｍＬ一个酶活单位定义为在３０～３７℃，ｐＨ３．０～３．７，一个大气压下，每分钟生成１μｍｏｌ二氧化碳的量，体积酶活定义为每ｍＬ草酸脱羧酶酶液中的酶活力单位数，体积酶活单位为Ｕ／ｍＬ；＊＊＊公式（１）其中，ΔＡ↓［３８０ｎｍ］＝ΔＡ↓［样品］－ΔＡ↓［空白］Ｖ↓［１］－最后的反应液总体积（ｍＬ）Ｔ－第一步草酸脱羧酶反应时间（ｍｉｎ）ν－待测酶液样品体积（ｍＬ）Ｖ↓［２］－第一步酶反应液总体积（ｍＬ）Ｖ↓［３］－参加第三步反应的酶反应液体积（ｍＬ）ｄ－比色皿光路直径（ｃｍ）ε↓［１］－ＮＡＤＨ在３８０ｎｍ处的吸收系数（１．３３Ｌ.ｍｍｏｌ↑［－１］.ｃｍ↑［－１］）。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：洪枫，朱翠侠，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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