多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法技术

本发明专利技术涉及一种多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法，是建立在特定探针设计、多元连接酶检测反应、多聚酶链式反应联用的基础上，对已知序列的单基因或多基因的任意突变位点同时进行基因精确分型的方法；本发明专利技术的有益效果是：能够对已知序列的单基因的任意位点进行精确基因分型；能够同时对已知序列的多个基因的任意位点进行精确基因分型；可以用于基因的高通量分型检测，或常规的低通量实验室操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因分型的方法，尤其涉及一种多元连接酶检测反应 等位基因精确分型的方法。技术背景在生命科学及医学研究中，基因分型已经逐渐成为医学、遗传学和基 因组学研究的热点问题之一。在理论研究方面，对于了解研究对象的遗传 背景具有非常重要的作用，在临床方面，对于为具有不同遗传背景患者(或 受检者)提供适当的诊断、治疗和预防措施也具有非常重要的意义。基因分型的依据是已知的遗传标记——即基因中不同的突变位点。由 于所用遗传标记的不同，应用的基因分型方法也不同。迄今已有多种基因分型的方法问世，如基因芯片法、ISSR、测序法等。如何提供一种利用多元连接酶检测反应对己知序列的等位基因任何位 点进行精确分型是科技技术人员要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供了一种多元连接酶检测反应等位基 因精确分型的方法，旨在解决上述的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下步骤实现的 根据待测序列和位点突变情况，设计一组"多元核酸引物/探针"，每组 至少包括引物h含该检测位点的配对碱基A，能与待测位点左端局部配对(退 火)，并与该待测位点的野生型完全配对；引物2:含该检测位点的不配对碱基C，能够与待测位点左端局部配对 或退火，并不与该待测位点的野生型配对；1条能够与待测位点右端局部配对或退火，并在5'末端带有磷酸基，同 时在3'末端带有荧光标记的AMLR探针；上述一组"多元核酸引物/探针"与待测脱氧核糖核酸序列混合，进行变性和退火，在反应体系中就可能形成两种杂交分子引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端 退火；引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端 退火；用Taq脱氧核糖核酸连接酶进行连接反应，则对于上述2种杂交分子 会产生不同的结果-由于引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端和待测位点均能够完全 退火，与右端退火的AMLR探针之间不会形成缺口，能够完成连接反应， 形成连接产物；由于引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子的待测位点不能够实现退火， 与右端退火的AMLR探针之间会形成单碱基不配对区，不能够完成连接反 应，无法形成连接产物；将反应体系进行热变性，只能得到引物l-AMLR探针的有效连接产物；对反应体系进行多聚酶链式反应，扩增引物l-AMLR探针的量即可供 荧光检测或电泳检测。对于突变型待测样本得到与上述相反的结果，即形成引物2-AMLR 探针连接产物；对于一个待测位点只存在两种等位基因形式的群体样本，最都可能会 有三种检测结果即单一的长扩增片段、单一的短扩增片段、长短扩增片段；如果待测位点具有多个突变形式，则在设计上只需增加相应特定引物的种类，无须改变AMLR探针；如需要改变检测位点，则二者的设计都应作相应改变。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是能够对已知序列的单基因的 任意位点进行精确基因分型；能够同时对已知序列的多个基因的任意位点 进行精确基因分型；可以用于基因的高通量分型检测，或常规的低通量实 验室操作。 附图说明图1是本专利技术原理示意图2是两种等位形式的待测群体多元连接酶检测反应单基因精确分型 结果示意图3是多基因待测群体多元连接酶检测反应基因精确分型结果示意图； 具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式对本专利技术作进一步详细描述由图l、图2可见根据待测序列和位点突变情况，设计一组"多元核酸引物/探针"，每组至少包括引物h含该检测位点的配对碱基A，能与待测位点左端局部配对(退火)，并与该待测位点的野生型(如图1中碱基T)完全配对(如图1中短引物)；引物2:含该检测位点的不配对碱基C，能够与待测位点左端局部配对 (退火)，并不与该待测位点的野生型(如图1中碱基T)配对(如图 1中长引物)；1条能够与待测位点右端局部配对(退火)，并在5，末端带有磷酸基(图 1中P)，同时在3'末端带有荧光标记(图1中FAM)的特定探针(如图1中AMLR探针)；上述一组"多元核酸引物/探针"与待测脱氧核糖核酸序列混合，进行变性和退火，在反应体系中就可能形成两种杂交分子引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端 退火；引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端 退火；用Taq脱氧核糖核酸连接酶进行连接反应，则对于上述2种杂交分子 会产生不同的结果-由于引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端和待测位点均能够完全 退火，与右端退火的AMLR探针之间不会形成缺口，能够完成连接反应， 形成连接产物； .由于引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子的待测位点不能够实现退火， 与右端退火的AMLR探针之间会形成单碱基不配对区，不能够完成连接反 应，无法形成连接产物；将反应体系进行热变性，只能得到引物l-AMLR探针的有效连接产物;对反应体系进行多聚酶链式反应，扩增引物l-AMLR探针的量即可供 荧光检测或电泳检测；对于突变型待测样本得到与上述相反的结果(即形成引物2-AMLR 探针连接产物)；对于一个待测位点只存在两种等位基因形式的群体样本，最都可能会 有三种检测结果即单一的长扩增片段、单一的短扩增片段、长短扩增片 段(参见图2);如果待测位点具有多个突变形式，则在设计上只需增加相应特定引物 的种类，无须改变AMLR探针；如需要改变检测位点，则二者的设计都应作相应改变；由图3可见样本分析根据待测样本的序列、待测突变位点的位置 和类型数设计试剂盒中的引物种类和数量； 合成相应引物和AMLR探针； 多元连接反应和多聚酶链式反应；电泳检测和荧光检测(可用核酸序列测定仪等仪器)。 应用本专利技术生产一类试剂盒，对特定已知序列等位基因的任意突变位 点进行分型。每个试剂盒的基本组成如下 长短不一的特定引物2条以上；相应的AMLR探针1条； Taq DNA连接酶检测体系； 脱氧核糖核酸多聚酶链式反应体系； 其他辅助试剂。权利要求1. 一种，是通过以下步骤实现的根据待测序列和位点突变情况，设计一组“多元核酸引物/探针”，每组至少包括引物1含该检测位点的配对碱基A，能与待测位点左端局部配对(退火)，并与该待测位点的野生型完全配对；引物2含该检测位点的不配对碱基C，能够与待测位点左端局部配对或退火，并不与该待测位点的野生型配对；1条能够与待测位点右端局部配对或退火，并在5’末端带有磷酸基，同时在3’末端带有荧光标记的AMLR探针；上述一组“多元核酸引物/探针”与待测脱氧核糖核酸序列混合，进行变性和退火，在反应体系中就可能形成两种杂交分子引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端退火；引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端退火；用Taq脱氧核糖核酸连接酶进行连接反应，则对于上述2种杂交分子会产生不同的结果由于引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端和待测位点均能够完全退火，与右端退火的AMLR探针之间不会形成缺口，能够完成连接反应，形成连接产物；由于引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子的待测位点不能够实现退火，与右端退火的AMLR探针之间会形成单碱基不配对区，不能够完成连接反应，无法形成连接产物；将反应体系进行热变性，只能得到引物1-AMLR探针的有效连接产物；对反应体系进行多聚酶链式反应，扩增引物1-AMLR探针的量即可供荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法，是通过以下步骤实现的：根据待测序列和位点突变情况，设计一组“多元核酸引物／探针”，每组至少包括：引物１：含该检测位点的配对碱基Ａ，能与待测位点左端局部配对（退火），并与该待测位点的野生型完全配对；引物２：含该检测位点的不配对碱基Ｃ，能够与待测位点左端局部配对或退火，并不与该待测位点的野生型配对；１条能够与待测位点右端局部配对或退火，并在５’末端带有磷酸基，同时在３’末端带有荧光标记的ＡＭＬＲ探针；上述一组“多元核酸引物／探针”与待测脱氧核糖核酸序列混合，进行变性和退火，在反应体系中就可能形成两种杂交分子：引物１与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，ＡＭＬＲ探针与其右端退火；引物２与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，ＡＭＬＲ探针与其右端退火；用Ｔａｑ脱氧核糖核酸连接酶进行连接反应，则对于上述２种杂交分子会产生不同的结果：由于引物１与待测目标脱氧核糖核酸分子左端和待测位点均能够完全退火，与右端退火的ＡＭＬＲ探针之间不会形成缺口，能够完成连接反应，形成连接产物；由于引物２与待测目标脱氧核糖核酸分子的待测位点不能够实现退火，与右端退火的ＡＭＬＲ探针之间会形成单碱基不配对区，不能够完成连接反应，无法形成连接产物；将反应体系进行热变性，只能得到引物１－ＡＭＬＲ探针的有效连接产物；对反应体系进行多聚酶链式反应，扩增引物１－ＡＭＬＲ探针的量即可供荧光检测或电泳检测。对于突变型待测样本得到与上述相反的结果，即：形成引物２－ＡＭＬＲ探针连接产物；对于一个待测位点只存在两种等位基因形式的群体样本，最都可能会有三种检测结果：即单一的长扩增片段、单一的短扩增片段、长短扩增片段；如果待测位点具有多个突变形式，则在设计上只需增加相应特定引物的种类，无须改变ＡＭＬＲ探针；如需要改变检测位点，则二者的设计都应作相应改变。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖爱军，邵永胜，刘志学，周磊，
申请(专利权)人：上海捷瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]