烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法技术

本发明专利技术公开了一种烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法，包括制备待测样品提取液；在ＨｙＰＵＲＩＴＹ　　Ｃ↓［１８］反相色谱柱上以Ａ相９９％水－１％乙腈－０．１％九氟戊酸和Ｂ相１０％水－９０％乙腈－０．１％九氟戊酸作为流动相梯度洗脱分离。针对现有液相色谱分析烟草及其制品中所含氨基酸含量的方法的不足，精确的限定了液相色谱分析的条件，提供了一个整体的完整的实验方案，获得良好的色谱峰形以及适宜的色谱运行时间，并且可使氨基酸同分异构体达到基线分离。本发明专利技术提供的色谱分离方法结合质谱检测能获得准确的烟草及其制品氨基酸含量的分析结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于化学分析检测
，具体涉及一种烟草及其制品 中所含氨基酸的液相色谱分离方法。技术背景氨基酸是烟叶中的重要组成部分，与烟气质量和巻烟品牌特征密切相关；氨基酸参与烟叶中的非酶棕色反应，即美拉德反应，此反应 可产生多种重要的致香成分。因此，研究烟草中的氨基酸，对于配方 研制、工艺生产和品质控制都有十分重要的意义。由于烟草中的氨基酸种类较多，且具有酸性、中性和碱性三种不 同的化学性质，加上烟草基质复杂，因此对烟草中多种氨基酸的同时 测定具有一定难度。目前，液相色谱(LC)法是较多使用的氨基酸 测定方法之一。由于氨基酸不具有紫外和荧光检测所需的发色基团， 若用液相色谱法进行检测，则必须对氨基酸进行柱前或柱后衍生。衍 生化操作步骤繁琐，耗时耗力，而且衍生化合物的稳定性难以直观的 评判，某些氨基酸衍生反应的完全程度也难以保证，同时衍生反应还 可能生成非目标衍生物，这些都会影响氨基酸的准确测定。自动氨基 酸分析仪也存同样的衍生问题。烟草成分相当复杂，用LC、自动氨 基酸分析仪、离子色谱(IC)和毛细管电泳(CE)等方法进行氨基 酸分析往往需要对样品进行固相萃取等繁杂的前处理，以减少干扰。 固相萃取等前处理会在一定程度上造成某些氨基酸(或氨基酸衍生物)的损失，而且有些干扰杂质也难以通过前处理消除。LC和IC等 色谱方法主要通过保留时间来识别化合物，因此必须花费较多时间摸 索色谱分离条件以及准确判定待测物，而且色谱方法都难以解决化合 物共流出的问题，致使某些待测化合物和干扰物不能区分。近年来，随着电喷雾离子化(ESI)和串联质谱(MS/MS)技术 的发展，液相色谱和电喷雾串联质谱联用(LC-ESI-MS/MS)在复杂 化合物分析中得到广泛的应用。但目前尚未见液相色谱和电喷雾串联 质谱联用技术在烟草样品氨基酸分析中应用的相关报道。液相色谱和电喷雾串联质谱联用，进行液相色谱分离操作时，条 件的设置例如温度、流动相等条件的选择对分离的效果有着显著的影 响。目前未见关于上述色谱分离方法的完整技术方案的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种准确、简便的烟草及其制品中所含氨基 酸的色谱分离方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来予以实现 提供一种烟草及其制品中所含氨基酸的色谱分离方法，包括以下(1) 制备待测样品提取液；(2) 在HyPURTTY C18反相色谱柱上以99%水-1%乙腈-0.1%九 氟戊酸(流动相A)和10%水-90%乙腈-0.1%九氟戊酸(流动相B) 作为流动相梯度洗脱分离。所述洗脱分离条件为热电HyPURTTY C18色谱柱200 mm x 2.1 mm， 5jim; Eclipse XDB-C8保护柱12.5 x 2.1 mm, 5 pm;流速 200 pL/min;柱温箱25°C;样品盘温度15°C;流动相A: 99%水 -1%乙腈-0.1%九氟戊酸，流动相B: 10%水-90%乙腈-0.1%九氟戊酸。所述二元流动相中流动相B所占的体积百分比小于25%。为了保证良好的保留时间重现性，更方便的进行定性定量分析， 在进样100针后，用100%乙腈冲洗色谱柱30 min，洗脱过多积聚的 NFPA，再用流动相平衡色谱柱后进样。本专利技术的有益效果是针对现有液相色谱分析烟草及其制品中所 含氨基酸含量的方法的不足，精确的限定了液相色谱分析的条件，提 供了一个整体的完整的实验方案，获得良好的色谱峰形以及适宜的色 谱运行时间，并且可使同分异构体亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(lie)、 缬氨酸(Val)和正缬氨酸(Nva)达到基线分离。本专利技术提供的色谱 分离方法结合质谱检测能获得准确的烟草及其制品氨基酸含量的分 析结果。 附图说明图120种氨基酸和内标正缬氨酸的提取离子流2加标前lie和Leu提取离子流3加标后lie和Leu提取离子流4加标前Val和Nva提取离子流5加标后Val和Nva提取离子流6 氨基酸的二级质谱图具体实施方式下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本专利技术。 实施例11、 仪器、材料与试剂美国热电公司LC-MS LTQ液相色谱-离子阱质谱仪，配备自动进 样器、四元梯度质谱泵，LTQ离子阱质谱带电喷雾电离源(ESI)， Xcalibur 1.4 SR1系统控制软件；意大利Claind N2LCMS氮气发生 器；法国Millipore Element A10纯水机；美国Cole-Parmer 8892超 声清洗器；Sartorious CP225D电子天平(Max 220g， d 二 0. 01 mg (80 g), 0.1 mg (220g)); Whatman 0. 2 p尼龙针式滤头；烟草粉末。 混合氨基酸标准溶液(Fluka公司)，含17种氨基酸，浓度各为IraM; 内标物L-正缬氨酸(上海丽珠东风生物技术有限公司)；天冬酰胺-水(上海伯奥生物科技有限公司)；色氨酸，脯氨酸和谷氨酰胺(国 药集团化学试剂有限公司)；广氨基丁酸(Sigma公司)；L-哌啶-2-羧酸、九氟戊酸(NFPA) (Aldrich公司)；甲醇和乙腈(MERCK公司)； 优级纯浓盐酸；Milli-Q级水，由Milliore Element A10制备，若 不经特别说明，实验中用水均为Milli-Q级水。 2、实验方法2. 1样品处理称取O. 1 0.2g烟末置于锥形瓶中，加入20mL含正缬氨酸浓度 为1. 7joM的0. 03MHC1溶液，超声震荡15min，摇荡锥形瓶片刻使溶 液浓度分配均匀，经0. 2Mm滤膜过滤后直接进样。2. 2 色谱条件热电HyPURITY (:18色谱柱(200 mm X 2. 1 mm， 5 Mm)，安捷伦Reliance保护柱套和Eclipse XDB-C8保护柱(12.5 X 2. 1 mm， 5 Pm)。进样方式全环(5 PL);流速200 PL/min;柱温箱25°C;样品盘温度15°C;注射器冲洗体积(flush volume):1000 ML;洗针体积(wash volume): 800叱。流动相A: 99%水-1% 乙腈-O. 1% NFPA;流动相B: 10%水-90%乙腈-0. 1% NFPA。流动相梯 度见表l。表l流动相梯度<table>table see original document page 8</column></row><table>2. 2质谱条件氮气压力0.64MPa;氦气压力0.38MPa;极 性正电离；扫描形式全扫描；采集时间40min;激活时间30ms; 吹扫气OLTQ单位；喷雾电压5kV;毛细管温度350°C;扫描范围标准；扫描速率标准；分段、分段时间、分离宽度、归一化碰 撞能量等设置见表2，其中第3分段的鞘气和辅助气分别为38LTQ单 位和0LTQ单位，其余分段的鞘气和辅助气分别为46LTQ单位和19LTQ单位。其他参数由自动调谐确定或依照LTQ质谱的默认设置。 表2分段、分段时间、分离宽度、归一化碰撞能量等条件设置氨基酸分段分段时间离子变换分离宽度归一化碰撞激活Q扫描范围AminSegmeSegmentTransitionsIsolation能量ActivatiMass ra本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法，其特征在于包括以下步骤：　　　　（１）制备待测样品提取液；　　　　（２）在ＨｙＰＵＲＩＴＹ　　Ｃ↓［１８］反相色谱柱上以Ａ相９９％水－１％乙腈－０．１％九氟戊酸和Ｂ相１０％水－９０％乙腈－０．１％九氟戊酸作为流动相梯度洗脱分离。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄翼飞，
申请(专利权)人：广东中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]