发现传统医药免疫调节作用的检测及筛选平台制造技术

本发明专利技术涉及一种检测或筛选传统医药免疫调节作用和抗肿瘤活性的方法。该方法包括应用蛋白组学领域使用的技术和分析工具从历史上一直被作为传统医药使用的天然原材料分离活性成分、刺激脾细胞以及确定和测定来自这种刺激作用的生物标记指示物。

【技术实现步骤摘要】
发现传统医药免疫调节作用的检测及筛选平台
技术介绍
传统医药如传统的中药的应用，可以追溯到五千多年前。历经多个世纪 的研究和实践，传统医药医师发现数千种植物和其它的自然产物具有特殊的医 疗效果。很多传统医药的原理是加强身体的免疫防御系统以攻克疾病或预防疾 病的形成。传统中医理论相信，疾病发作是源于身理上某些欠缺的形成。所以，扶正治疗是TCM其中一个主要的原理，意为在各类疾病中"促进或加强自然宿 主的防御机制"。近年来，传统医药在免疫系统方面的正面效果已得到证实。 但是，根据传统的医疗实践， 一种特定成分治疗一种特定的疾病的疗效，要待 至病人服用了这个特定成分并对疗效结果进行分析后才能得知。因而应用于传 统医药的检测及筛选方法将有助于医师在给病人服用特定成分之前就能了解 该成分的疗效。蛋白组学是指研究一个细胞/组织/器官内所有蛋白质的特性，如表达水 平、翻译后修饰、蛋白与蛋白相互作用等，从而获得一个完整和综合的蛋 白质水平的疾病过程、细胞过程和网络的概念。研究蛋白组学的目的是了 解细胞或组织来源的蛋白质。可以通过对患病和健康样本进行比较而进行。目前分析蛋白组分两个阶段进行第一，对"正常"状态下的特定有机体、组织或细胞表达的蛋白质进行鉴定，和其在双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D) 的定位；第二，测定在对应生理/疾病状态发生变化时蛋白组的变化。在现 有技术中，蛋白组学已经应用于提供一个细胞或组织的蛋白质谱，可以比 较健康和疾病状态的蛋白质之间的区别用于寻找药物或药物靶标。蛋白组 学也已经用作分析药物候选物的潜在用途。肿瘤坏死因子(TNF-a)于1975年被Memorial Sloan-Kettering Cancer Center的Lloyd Old及其同事们发现并被确认为是一种具有抗癌活性的活 性成分。TNF-a的主要细胞来源是LPS激活的单核吞噬细胞。TNF-a引起肿 瘤体外出血性坏死并表现出体外抗癌细胞的细胞毒性。TNF-a其他的生物 学功能包括能够引起内皮细胞表达新的表面受体，该受体使内皮细胞表面变得对白细胞具有粘附性，先是对嗜中性粒细胞之后是对单核细胞和淋巴 细胞具有粘附性，并激活炎性白细胞杀死细菌和激活嗜中性粒细胞，以及刺激其它的单核吞噬细胞产生细胞因子，如IL-1、 IL-6、 TNF-a和趋化因子。千扰素(IFN)是一种众所周知的具有高效力的细胞因子，具有免疫系 统之内和之外的多种生理功能。IFN-y是由胸腺来源(T)细胞在激活状态 下分泌的，IFN-y也可以由自然杀伤细胞分泌而来。IFN已知能够诱导酶的 合成，该酶直接导致大量活性氧离子的爆发，使巨噬细胞杀死肿瘤细胞。 IFN-y其他性能包括，它是单核吞噬细胞有效力的激活剂、增加I级MHC分 子的表达、促进细胞和体液体内免疫反应、直接作用于T-和B-淋巴细胞促 进分化、促进CD4+T细胞的分化、成为用于CD8+CTLs成熟作用的细胞因子 之一，和激活嗜中性粒细胞。一氧化氮(NO)是存在于多种哺乳动物细胞内的一种多功能分子，参 与广泛的生理学和病理生理学过程，如血管舒张、神经传递、杀肿瘤和细 菌活动和免疫抑制。 一氧化氮是被称为一氧化氮合成酶(NOS)的酶家族 使用精氨酸作为底物合成的。细胞因子可诱导的形式，iNOS，是由许多免 疫系统产生的刺激而激活的，如IFN-y、 TNF-a和LPS，并且催化可以成为 细胞毒素的NO的大量生成。以前的工作表明巨噬细胞释放出的NO是杀细 菌和杀肿瘤活动的介体。NO显示与几种诱导凋亡的信号转换机制有关，例 如，iNOS的诱导导致NO的积聚，引起凋亡典型的形态学和生物化学上的改 变，包括半胱天冬酶-3的激活和多ADP-核糖聚合酶(PARP)的退化。具有免疫调节作用的医用品和/或药物候选物能够刺激抗肿瘤因子如 IFN-y、 TNF-a、 iNOS的生成。按照传统医药的体外应用，确定和检测这种 细胞因子能够建立将所述药物作为一种抗肿瘤工具的潜在用途。本专利技术者在此认为蛋白组学的方法和工具在传统医学上的应用，可开 发有效力的传统医药的检测及筛选平台。这种检测平台通过所提供的确切 的活性作用机制的信息，有助于对特殊天然原材料的理解。
技术实现思路
为了使读者在此了解本专利技术，本专利技术者提议； 本专利技术的目的是开发一种用于传统医药的检测及筛选平台，本专利技术通过利用生物标记，包括但不局限于IFN-Y、 TNF-a、 iNOS，和利用蛋白组学领域的方法和工具来达到目的，还要达到其它的目的和获得不同的方法，如克服现有技术中存在的缺 陷和问题。以上所述不是作为对本申请的限制，而是总体上包含在本申请之中。 本专利技术设备和方法的特性、内容和优势将由以下描述、权利要求和附图而得到更好的理解，在附图中图l表示根据本专利技术确定一种传统医药是否具有抗肿瘤特性的方法。图2为按照本专利技术的方法分离出的脾细胞的影像，用于实例。图3A、 3B和3C为用Rgl， 一种来自多种草药如人参的皂苷，对脾细胞的刺激作用之后，对TNF-a、 IFN-Y、 iNOS的Western印迹结果，用于实例。 图4表示经过和未经过Rgl (5pg/mL)处理的脾细胞分泌IFN-Y和TNF-a含量的时长。图5为脾细胞在Rgl存在或缺失情况下差异蛋白的表达，用"二合一"凝 胶进行比较，用于实例。图6为通过总结Rgl对脾细胞蛋白质表达和可能的调节机制，表明Rgl 对脾细胞蛋白质表达的影响，用于实例。以下对示范性实施例的描述本质上仅是作为示范，而不是用来限制本 专利技术、其应用或用途。通篇描述所使用的术语"脾细胞"是指所有从脾脏分离 出来的白血细胞。术语"生物标记指示物"为能够被检测和/或测定的指示物，这种指示物 一般通过生物学方法而产生。 现在专门描述图l-6。图l为本专利技术的实施方法，包括如下步骤，获取脾细胞101，刺激脾细 胞103，和测定免疫调节作用105。该方法结合脾细胞的使用和特定蛋白质 的分析，在检查超过100种蛋白质的同时表达时，确定一种特定活性剂的效 果。该方法因而可以对众所周知的传统医药的天然原材料进行大规模检测。获取脾细胞101脾细胞可以通过本领域已知的实验方法而获得，所述实验方法包括如下步 骤，获取一个脾脏，切碎该脾脏，用已切碎的脾脏制备悬浮液，孵育由悬浮液而来的细胞，分离脾细胞，以及收集脾细胞。脾脏可以取自任何适于用作药物 检测的哺乳动物，如大鼠、狗、猫、小鼠、豚鼠、牛、鹿、猴子，等等。脾脏 移除可通过已知的脾切除术来完成，如剖腹术切除、腹腔镜切除、无菌切除等。 所获得的脾脏然后用切开、碾磨、捣碎脾脏和将脾脏切成薄片等方法切碎。其 它的工具如筛子，也可用来切碎脾脏。制备脾脏悬浮液，如单个细胞的悬浮液， 然后进行孵育。孵育的方法可用已知的实验室法进行，包括培养皿、琼指平板、 微量滴定板和利用发酵罐的批量处理法。孵育可以在包括如下生长因素的环境 中进行，如琼脂、营养物、盐、氨基酸、糖或抗生素；所述环境包括一到多个 用于互相结合的生长因素。在一项实施例中，孵育在包括1000U/mL青霉素、 链霉素(PS)和5%柠檬酸葡萄糖的环境中进行。在孵育之后，可以通过很多方法将脾细胞从培养物分离出来，如离心、 梯度离心、滤压、机械压、旋转式过滤、立轴分离器离心(vertical spind本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测传统医药免疫调节活性的方法，包括步骤：　　　　获取脾细胞；　　　　用活性成分溶液刺激所述脾细胞；和　　　　确定生物标记指示物的存在。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢俊立，黄文秀，王渊渊，
申请(专利权)人：香港理工大学，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]