3-羰基海棠酮与提取方法及在制备抗肿瘤药物中的应用技术

3‑羰基海棠酮与提取方法及在制备抗肿瘤药物中的应用，3‑羰基海棠酮的结构如(I)所示。所述的3‑羰基海棠酮的提取方法，包括以下步骤：1)昆明山海棠根茎粉碎，乙醇提取，减压浓缩得到浓缩液；2)将浓缩液先后用石油醚、二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷萃取液，浓缩至小体积得到样品浓缩液；3)在高速逆流色谱仪中，分离样品浓缩液，收集主流份；主流分减压浓缩后至小体积经凝胶柱色谱Sephadex‑LH20纯化。该化合物对肺癌等实体肿瘤具有显著的抑制活性，能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制新生血管生成，在肺癌荷瘤小鼠体内显著抑制肿瘤的生长和转移，延长小鼠生存期。因此，还提供了3‑羰基海棠酮在制备抗肿瘤药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
3-羰基海棠酮与提取方法及在制备抗肿瘤药物中的应用
本专利技术涉及从天然植物中提取的新化合物及提取方法及其在制备药物中的应用。
技术介绍
昆明山海棠(Tripterygiumhypoglaucum(Lévl.)Hutch)是卫矛科雷公藤属植物，多以其根入药，具有祛风湿、祛痪通络、续筋接骨的功效。其可药用部位中存在多种松香烷型二萜类化合物，且现有技术报道中对其抗肿瘤活性也有一定中国文献——昆明山海棠根茎的化学成分研究(宋强等，中草药杂志，2019年11月，5395～5399)公开了一种松香烷型二萜类化合物——3β-羟基-4-4羟甲基-阿松香-8，11，13-三烯-7-酮(该文献中命名为海棠酮)，其结构式如下：但并未报道其具体药理活性。在研究中我们发现，在昆明山海棠中，还存在其他与海棠酮结构类似的松香烷类二萜型化合物，且与海棠酮的药理活性均有区别。因此，对昆明山海棠的可药用部位的进一步进行提取分析，分离出新的具有药理活性的化合物，成为现有技术中亟待解决的问题。
技术实现思路
为解决上述问题，我们改进了现有的昆明山海棠可药用部位活性成分的提取和分离工艺，得到的一种新的具有抗肿瘤活性的松香烷型二萜类化合物。发现其对多种肿瘤细胞都表现出一定的抑制活性，且对某些特定的肿瘤产生的较强的抑制效果。基于此，本专利技术提供的技术方案为：3-羰基海棠酮(I)，其特征是所述化合物的结构如下式(I)所示：本专利技术还提供了的3-羰基海棠酮的提取方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：1)昆明山海棠根茎粉碎，以乙醇提取，收集提取液，减压浓缩提取液得到浓缩液。2)将浓缩液先用石油醚萃取，再以二氯甲烷对萃余相进行萃取，收集二氯甲烷萃取液，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，将二氯甲烷萃取液浓缩至小体积得到样品浓缩液。3)以二氯甲烷-甲醇-水按体积比6∶4∶1混合，静置24h分层，取上相为固定相泵入高速逆流色谱仪中，下相为流动相，以5ml/min泵入色谱仪，转速800rpm，待所有多余固定相溢出分离柱时体系完成平衡，调整流动相流速为2ml/min，将样品浓缩液注入色谱仪，在紫外检测器下进行监测，收集主流份；主流分减压浓缩后至小体积经凝胶柱色谱Sephadex-LH20纯化纯化，以二氯甲烷-甲醇(体积比2∶1)洗脱，在紫外检测器下进行监测，收集各流分，将各流分减压浓缩后经制备型反相色谱纯化。所述的提取方法，其特征在于：步骤1)中，乙醇的体积百分含量为80％～96％，所述乙醇与昆明山海棠根茎的体积重量比为40～60。本专利技术还提供了所述3-羰基海棠酮在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的应用，进一步，所述的肿瘤为实体肿瘤，优选肺癌、结直肠癌、胰腺癌，最优选肺癌。本专利技术提供的提取自昆明山海棠的3-羰基海棠酮，在药理活性研究中发现，该化合物能在对多种正常细胞系的毒性较小，对多种实体肿瘤细胞的生长具有抑制作用，其中对肺癌、结直肠癌、胰腺癌肿瘤细胞的抑制作用较为显著，尤其是对肺癌细胞的抑制作用更为突出。3-羰基海棠酮能够显著抑制肺癌细胞的克隆形成能力，诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤新生血管生成；在荷瘤小鼠生存实验中，3-羰基海棠酮能够具有显著抑制肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长和转移，显著延长荷瘤小鼠的生存期。附图说明图1为实施例3中3-羰基海棠酮对肺癌细胞克隆形成能力影响的实验结果图；图2为实施例4中3-羰基海棠酮诱导肺癌细胞凋亡在流式细胞仪的检测结果图；图3为实施例5中3-羰基海棠酮对HUVEC细胞微血管形成能力影响的实验结果图；图4为实施例6中小鼠肺癌模型经3-羰基海棠酮用药治疗后的IVIS小动物成像实验结果图。具体实施方式实施例13-羰基海棠酮的提取与鉴定取10kg昆明山海棠根茎粉碎，过10目筛，以500L95％乙醇分三次超声提取，启动功率3kw，频率40kHz，过滤收集提取液，减压浓缩提取液至无醇味得到浓缩液。浓缩液依次用石油醚，二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷萃取液，用2倍量饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次，将二氯甲烷萃取液浓缩至小体积得到样品浓缩液。再以二氯甲烷-甲醇-水按6∶4∶1混合，静置24h分层，取上相为固定相泵入高速逆流色谱仪中，下相为流动相，以5ml/min泵入色谱仪，转速800rpm，待所有多余固定相溢出分离柱时体系完成平衡。调整流动相流速为2ml/min，将样品浓缩液注入色谱仪，在紫外检测器下进行监测，收集主要流份。主流分减压浓缩后至小体积后经凝胶柱色谱Sephadex-LH20纯化，以二氯甲烷-甲醇(体积比2∶1)洗脱，在紫外检测器下进行监测，收集各流分，将各流分减压浓缩后分别经制备型反相色谱纯化，并分别进行波谱分析，发现了其中一种52mg的白色固体(纯度95.3％)为新的化合物，对该化合物进行波谱鉴定，其结构如下式(I)其1HNMR和13CNMR数据如下表(500/126MHz，DMSO-d6)经与文献报道的海棠酮波谱数据相比对，确定该化合物3位存在羰基，确定其化学结构为3-羰基海棠酮，如式I所示，经系统文献检索，发现该化合物为未见报道的新化合物，命名为3-羰基海棠酮。实施例2MTT法检测3-羰基海棠酮和海棠酮的体外抗肿瘤活性实验原理：MTT，化学名3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴)，是一种通用的细胞染色剂。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的琥珀酸脱氢酶，可将外源性黄色MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲臜(Formazane)，并沉积在细胞中，死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解Formazane后用酶标仪在550nm波长处检测光密度的变化大小，即可显示检测体系中细胞存活和生长状况。人们经常使用MTT法来衡量测试药物对细胞的生长抑制作用，进而评价细胞毒性。实验目的：通过MTT法检测3-羰基海棠酮和现有化合物-海棠酮对不同正常细胞系和肿瘤细胞系的抑制活性，比较二者对不同肿瘤细胞抑制活性的差异。实验步骤：将3-羰基海棠酮和海棠酮分别溶解于DMSO，配置100uM母液，-20℃保存。体外培养四种正常细胞系(人正常肺上皮细胞HBEC、人正常乳腺上皮细胞MCF10A、人正常肝细胞LO2、人脐静脉内皮细胞HUVEC)和十种肿瘤细胞系(人肺腺癌细胞A549、人肺腺癌细胞H1299、人胃癌细胞MGC-803、人乳腺癌细胞MCF7、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人结直肠癌细胞SW620、人肝癌细胞HepG2、人胰腺癌细胞PANC-1、人前列腺癌细胞PC3、人宫颈癌细胞Hela)。将培养好的细胞用0.25％的胰酶消化，吸出胰酶后，用含10％FBS的培养液终止消化，混匀细胞悬液，计数调节密度为1x104，将调好的细胞悬液加于96孔板，每孔180ul，置于37℃，5％CO2的孵箱内培养24小时，24小时后加入不同浓度的3-羰基海棠酮或海棠酮，每个浓度5个复孔，加好药后继续置于37℃，5％C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.3-羰基海棠酮(I)，其特征是所述化合物的结构如下式(I)所示：/n

【技术特征摘要】
1.3-羰基海棠酮(I)，其特征是所述化合物的结构如下式(I)所示：





2.如权利要求1所述的3-羰基海棠酮的提取方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1)昆明山海棠根茎粉碎，以乙醇提取，收集提取液，减压浓缩提取液得到浓缩液；
2)将浓缩液先用石油醚萃取，再以二氯甲烷对萃余相进行萃取，收集二氯甲烷萃取液，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，将二氯甲烷萃取液浓缩至小体积得到样品浓缩液；
3)以二氯甲烷-甲醇-水按体积比6∶4∶1混合，静置24h分层，取上相为固定相泵入高速逆流色谱仪中，下相为流动相，以5ml/min泵入色谱仪，转速800rpm，待所有多余固定相溢出分离柱时体系完成平衡，调整流动相流速为2ml/min，将样品浓缩液注入色谱仪，在紫外检测器下...

【专利技术属性】
技术研发人员：李西川，周晓涛，山长亮，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12