一种噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种噬菌体抗体库，是在ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ载体的ＳｆｉＩ和ＮｏｔＩ酶切位点间组装ＳｃＦｖ基因片段，其特征在于：所述的ＳｃＦｖ基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体，并将其应用于农药残留免疫测定中。其优点是：可以不经动物免疫获得高亲和力抗体，试验周期短，此抗体库以十六元大环内酯共性结构小分子米尔比霉素肟化物为免疫原构建的噬菌体抗体库，理论上经过筛许可以直接获得十六元大环内酯类化合物的特异性抗体库，其筛选通量高、效率高、特异性强及亲和选择范围广，使其在农药抗体制备和检测技术发展等方面具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种噬菌体抗体库及其应用，尤其是一种能检测十六元大 环内酯类农药小分子特异性的抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用， 属于一种利用噬菌体展示技术构建的抗体库并将其用于农药残留免疫测 定的范畴。
技术介绍
痕量农药免疫测定技术是一项目前国内外广泛研究和大量使用的农 药残留筛选测定技术。它集测定的高灵敏性和抗体反应的强特异性于一 体，具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、样品需要量少等优点，在农 药的痕量检测方面取得了丰硕的成果。其中，小分子农药的抗体制备是核 心内容，目前正呈现和快速发展的分子生物学技术相融合的形势。从天然的或免疫的小鼠脾细胞或杂交瘤细胞提取抗体基因，以改建的噬菌体为载体构建抗体库，与ELISA法相结合，从已构建的展示库中筛选 具有针对农药小分子半抗原的特异性抗体已成为研发热点，即对农药小分 子半抗原进行设计和改造，合成人工抗原，将抗原包被在酶标板上，然后 加入己构建好的待筛选的噬菌体，根据抗原抗体亲和性的大小，经过吸附 一洗脱一扩增的筛选过程，从而得到针对农药小分子的高亲和抗体。利用 噬菌体展示技术构建的抗体库可用于农药小分子抗体的筛选，或从特异性 较高的偏向性库中筛选具有相同结构的一类小分子抗体。Carlos等1993年 就报道了从半合成抗体库中筛选三种小分子半抗原的高亲和力抗体；Yi Li 等在也在混合小分子抗体库中筛选出阿特拉津，西玛津，异丙隆，2甲4 氯丙酸等四种除草剂小分子半抗原的高亲和力抗体；J.Bricheta等也从构建 的天然抗体库中筛出除草剂2，4-D的抗体。而目前针对十六元大环内酯类 农药具有特异性识别的抗体，并以此构建的抗体库还未见报道。目前国内外农药免疫检测技术已发展到通用型免疫检测，即制备得到 的共性结构抗体(Generic structure antibody)。该种抗体利用抗体针对某些含有共有基团的农药产生交叉反应，制备一种抗体来检测多种农药，在农 药残留的定性筛选检测中有独特的优势，尤其是针对一类农药品种的定性捡测。Alococer等用有机磷的通用结构瞵酸做半抗原制备了广谱性的多克 隆抗体，对10种以上的有机磷农药有特异性识别，将其应用于传感器分 析中取得了较好的效果。Goodrow利用均三氮苯类除草剂的通用结构作半 抗原制备的抗体对莠去津、扑草津、扑灭津均有特异性识别。但还没有采 用共性抗体库技术的报道，本研究利用共性结构抗体库筛选的到的抗体其 最低检测限及检测灵敏度较传统的多抗均有一定的优越性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对目前利用噬菌体展示技术构建的抗体库中没 有对十六元大环内酯类农药具有特异性识别的抗体，而提供一种新的噬菌 体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对目前利用噬菌体展示技术构建的抗体库中没 有对十六元大环内酯类农药具有特异性识别的抗体，而提供一种新的噬菌 体抗体库及其在农药残留免疫中的应用。本专利技术的目的是这样实现的 一种噬菌体抗体库，是在pCANTAB5E 载体的SfiI和NotI酶切位点间组装ScFv基因片段，其特征在于所述的 ScFv基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性 单链抗体。在本专利技术涉及的噬菌体抗体库中所述的ScFv基因片段是这样构建的a) MILO-BSA免疫Balb/c小鼠后，提取小鼠脾细胞总RNA，以其为 模板，Oiigo(dT)m为引物合成cDNA第一链；b) 根据设计的多组简并性引物经RT-PCR法分别扩增抗体重链可变区VH和轻链可变区VL基因；c) 分别以近等摩尔量的所有引物扩增条带的Vh和VL合并片段为模 板，采用重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension, SOE)将二者拼接成ScFv基因，大小在750bp左右，再分別将等量的VhB和VJ各条引物混合并以二者为引物进一歩PCR扩增ScFv基因；将构建的ScFv基因片段与pCANTAB5E载体连接与转化。 在本专利技术涉及的噬菌体抗体库中ScFv基因片段的核苷酸和氨基酸序列为atg gcc gag gtg caa ctt gtt gaa tct ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg tea ttg 60 Met Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly Ser Leu15 10 15 20aaa etc tea tgt gca gcc tct gga ttc sec ttc aat acc tac gcc atg aac tgg gtc cgc 120 Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg 21 25 30 35 40cag get cca gga aag ggt ttg gaa tgg gtt get cgc ata agg agt aaa agt aat aat tat 180 Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg lie Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr 41 45 50 55 60gca aca tat tat gcc gat tea gtg aag gac agg ttc acc ate tec aga gat gat tea ca_a 240 Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Gin 61 65 70 75 80age atg etc tat ctg caa atg aac aac ttg aaa act gag gac aca gcc atg tat tac tgt 300 Ser Met Leu Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 81 85 90 95 100gtg aga cgt gat cgc ttt gac tac tgg ggc caa ggc sec att etc aca gtc tec teg ggt 360 Val Arg Arg Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr lie Leu Thr Val Ser Ser Gly 101 105 110 115 120ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tec ggt ggt ggt gga tec gac att gtg atg act cag 420 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Val Met Thr Gin 121 125 3_30 135 140tct cca tec tec ctg agt gtg tcei gca gga gag aag gtc a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种噬菌体抗体库，是在ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ载体的ＳｆｉＩ和ＮｏｔＩ酶切位点间组装ＳｃＦｖ基因片段，其特征在于：所述的ＳｃＦｖ基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘贤金，张晓，刘媛，余向阳，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]