一种乙基对硫磷竞争半抗原和竞争原及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种乙基对硫磷竞争半抗原，其分子结构式为如右，其中ｎ＝１～６，Ｒ为以１个、２个或两两之间组合的形式存在于苯环上的原子或基团。本发明专利技术还同时提供了利用上述乙基对硫磷竞争半抗原所制成的乙基对硫磷竞争原。本发明专利技术还同时提供了利用上述乙基对硫磷竞争原和免疫原ＰＢ－ＢＳＡ所建立的异源ＥＬＩＳＡ分析方法，能用于检测食品、农产品和环境样品中乙基对硫磷的残留量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种乙基对硫磷竞争半抗原和竞争原的结构及其用途，属于农药免疫化学

技术介绍
分子量小于1000道尔顿的小分子有毒化学品如农药及其代谢产物，其传统的残留分析 方法主要是依靠气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)、气质联用(GC/MS)或液质联用 (HPLC/MS)等理化分析手段。但仪器分析方法具有前处理步骤繁琐、溶剂消耗量大、耗 时长等缺点，难以满足对大量样品进行低成本快速筛选的需要。因此人们迫切希望有一 种简单、快速、灵敏及价廉的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的筛选试验； 免疫化学分析技术正是由于具备这些优点，已成为最有应用价值和发展潜力的痕 量分析技术之一。目前这一技术已经成为农药残留痕量分析研究的一个崭新领域， 被列位当前优先研究、开发和利用的农药残留分析技术，世界粮农组织(FAO)已 向许多国家推荐此项技术，美国EPA将免疫分析技术与气相色谱、液相色谱共同列 为农药残留分析的支柱技术。免疫分析方法根据其检测原理又可分为竞争法和非竞争法。竞争法由于比非竞争法具 有灵敏度高和抗基质干扰能力强的优点，而应用最为广泛。竞争免疫分析方法根据其包被 原或酶标半抗原结构与免疫半抗原结构的异同，又可分为同源免疫分析(Homologous Assays)和异源免疫分析(HeterologousAssays)方法。同源分析，即用同一种半抗原制备 的人工抗原与相应的抗体进行免疫分析，也是目前在农药和兽药的免疫化学分析方法中及 其试剂盒开发中最常用的方法。同源分析由于免疫半抗原和免疫分析中使用的包被原或酶 标半抗原均采用同一种半抗原，经不同偶联方法与不同蛋白质(BSA、 OVA、 KLH等)连 接，半抗原合成数量较少，省时省力。但是同源分析对基质效应的抗干扰能力弱，对实际 环境样品的检测常因有基质影响而出现方法灵敏度低。而且，目前免疫化学分析方法发展 遇到的最大"瓶颈"问题就是同源分析中小分子农药与抗原相比对抗体的竞争力低，以及 应用于实际环境样品分析时往往因为基质效应而出现灵敏度大大下降，最终致使免疫方法与仪器检测能力有一定差距，导致免疫化学分析方法在实际中的应用受到限制。这也是困 扰农药快速检测技术进行商业化转化(如开发快速检测试剂盒、金标试纸等产品)所面临 的最为关键的问题。而异源分析则能增加小分子农药对抗体的竞争力，增强方法对基质效 应的抗干扰性，大大提高方法的灵敏度。另外，异源分析还具有提高方法特异性、增加抗 体用途、通过改变包被原和免疫半抗原的组合发展多残留检测方法等优点。异源分析，是指用同一种分析物的不同半抗原所得的抗体分别与不同半抗原所制备的 包被原或标记抗原进行的免疫分析。其中，采用与免疫半抗原不同的半抗原即是竞争半抗 原，包括包被半抗原与酶标半抗原。目前，异源分析技术发展还多注重在证明异源分析的 优越性和发展不同农药的异源分析测定方法上，对竞争半抗原合理设计的研究还属于起步 阶段。与免疫半抗原设计不同的是，免疫半抗原设计的目的是为了设计能与目标物最大程 度相似的半抗原从而得到高特异性的抗体，而最佳竞争半抗原的设计要求不仅是要与目标 物不相似，同时还需要与免疫半抗原不相似，因此需要满足两方面的要求，而且不相似的 设计空间更大，设计难度也随之增加。乙基对硫磷是一种应用广泛的高毒有机磷酸酯类杀虫剂，主要用于防治水稻、棉花、 玉米等农作物上的多种害虫。乙基对硫磷毒性分级属高毒类，有"三致"作用。侵入途径 分为吸入、食入、经皮吸收。误食被乙基对硫磷污染的食物(包括瓜果、蔬菜、乳品、 粮食、水产品以及被毒死的禽畜等)，对人体健康危害极大，急性中毒表现为抑制胆碱酯 酶活性，造成神经生理功能紊乱；慢性中度症状一般并不很明显，临床表现多为神经衰弱 综合症，部分患者可出现毒蕈碱样和烟碱样症状，少数患者还可有屈光不正、视野縮小、 色觉障碍等视觉功能损害，可有神经-肌电图改变和脑电图异常。由于乙基对硫磷毒性较高, 近年来已被禁止在蔬菜、水果上使用，但在农产品的进出口贸易、食品和环境安全的监督 检测中，乙基对硫磷等一类高毒化合物仍然是常规检测的重要污染物。而且，乙基对硫磷 与其它农药的复配也日益增多；因此迫切需要能够快速检测农产品中乙基对硫磷残留量的 方法，以保证人民群众的健康安全，以及我国农产品的顺利出口。传统的乙基对硫磷检测方法有气相色谱(GC)，液相色谱(HPLC)或质谱(MS)等， 样品前处理过程复杂、工作量大、仪器昂贵、要求有熟练的技术人员及较长的分析周期， 而且微量的目标分析物容易丢失，难以满足大量样本现场快速检测的需要。免疫分析为乙 基对硫磷的快速残留分析提供了一个新的分析检测途径。前人有建立同源免疫分析方法应 用于乙基对硫磷的残留检测，但是由于免疫原结构对抗原决定簇改变太多，而导致抗体亲和力低、特异性差，而且同源分析抗基质干扰能力差，导致建立的同源免疫分析方法很难 应用于实际环境样品和农产品的检测，这也是没有成熟的乙基对硫磷商品化试剂盒面世的 主要原因。而异源免疫分析方法的优点(尤其是其抗基质干扰效应的优势)使之成为解决 这个问题的很好手段。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能够建立高灵敏度、高特异性的异源免疫分析 方法的竞争半抗原和竞争原，还提供了其用途。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种乙基对硫磷竞争半抗原，其分子结构式为NH——(CH2)n——COOH ;其中n二l 6， R为以1个、2个或两两之间组合的形式存在于苯环上的原子或基团。也就是说该类原子或基团以邻位、对位或间位 的形式位于苯环上。作为本专利技术的乙基对硫磷竞争半抗原的改进原子为F、 Cl或Br;基团为OCH3、 CH3、 C2H5、 N02或C(CH3)3。本专利技术还同时提供了一种利用上述乙基对硫磷竞争半抗原所制成的乙基对硫磷竞争 原，其分子结构式为本专利技术还同时提供了一种利用上述乙基对硫磷竞争原和免疫原PB-BSA所建立的异源 ELISA分析方法，其特征在于用于检测食品、农产品和环境样品中乙基对硫磷的残留量。本专利技术是针对现有技术中同源分析的不足之处，设计了一种乙基对硫磷竞争半抗原及 相应的乙基对硫磷竞争原，其能用作动物免疫的抗原体系的原料。本专利技术的乙基对硫磷竞争半抗原以三氯硫磷为起始原料，先与无水乙醇反应生成0-乙基硫代磷酰二氯，再与苯酚类化合物生成反应中间体硫代磷酰一氯，最后与氨基酸反应生成竞争半抗原。反应式如下<formula>formula see original document page 6</formula>其中n二l 6; R表示F、 Cl、 Br、 OCH3、 CH3、 C2H5、 N02、 C(CH3)3等原子和基团 以1个、2个或两两之间组合的形式存在与苯环上(邻位、对位、间位)。本专利技术提出的乙基对硫磷竞争半抗原，主要是针对抗原决定簇部位进行改变，从而减 少抗体与竞争原之间的亲和力，增加免疫分析中抗体对乙基对硫磷的识别能力和效率，从 而提高方法的灵敏度。目前报道的有关乙基对硫磷的ELISA分析方法对标样的最低检测限 (IC1Q)大多为2-50 ng/mL之间，但建立的ELISA方法应用于实际农产品和环境样品检测 的报道不多，已有报道中最低检出浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙基对硫磷竞争半抗原，其特征在于分子结构式为：　　　　＊＊＊；其中ｎ＝１～６，Ｒ为以１个、２个或两两之间组合的形式存在于苯环上的原子或基团。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘毅华，赵金浩，王春梅，郭逸蓉，桂文君，程敬丽，朱国念，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]