健康状态的测定法制造技术

本发明专利技术涉及用检测病毒的存在与检测指示健康状态的基因组靶标或标记的存在的组合来检测确定受试者健康状态的测定法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术通常涉及检测样品中病毒存在的以及检测基因组标记，作为用于 确定受试者健康状况的一种测定法。本专利技术适合作为具有预后意义的风险评
技术介绍
目前多种方法可以用于检测特异核酸分子。这些方法通常都依赖于靶核 酸和核酸探针之间的序列依赖性杂交，其中核酸探针的长度范围可以是从短寡核苷酸(20个碱基或更短)至许多千碱基(kb)的序列。从总的核酸序列中扩增特异序列，最广泛采用的方法是聚合酶链式反应 (PCR)(Dieffenbach， C and Dveksler， G.eds. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)。在该扩增方法中，在互补DNA链 上且在待扩增区域的任一端处的长度通常为20-30个核苷酸的寡核苷酸，用 于在变性的单链DNA上引导DNA合成。变性、引物杂交以及使用热稳定的 DNA聚合酶的DNA链合成的连续循环使引物之间的序列呈指数扩增。通过 首先复制，可扩增RNA序列，该首先复制使用反转录酶产生互补DNA(cDNA) 拷贝。扩增的DNA片段可通过多种手段进行检测，包括凝胶电泳、与标记 的探针杂交，采用允许后续鉴定(例如通过酶联反应)的标记引物，以及采用 一旦与靶标DNA杂交即产生信号的荧光标记引物(例如Beacon和TaqMan 体系)。同PCR —样，多种用于检测和扩增特异的核苷酸序列的其它技术己得以 发展。 一个实例就是连接酶链式反应(Barany，F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,189-193,1991)。另一个实例是1992年首次描述并命名为链置换扩增(Strand Displacement Amplification, SDA)的等温扩增(Walker GT， Little MC， Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restrictionenzyme/DNA polymerase system. PNAS 89:392-396(1992))。从那时起，己经描 述了大量其它等温扩增技术，包括转录介导的扩增(Transcription Mediated Amplification, TMA)和基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA)，其利用RNA聚合酶来复制RNA序列而不是相应的 基因组DNA。 (Guatelli JC， Whitfield KM, Kwoh DY, Barringer KJ, Richmann DD and Gingeras TR. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. PNAS 87: 1874-1878 (1990): Kievits T, van Gemen B, van Strijp D， Schukkink R, Dircks M， Adriaanse H, Malek L, Sooknanan R, Lens P. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods. 1991 Dec; 35(3):273隱86)其它基于DNA的等温技术包括滚环扩增(Rolling Circle Amplification, RCA)，其中DNA聚合酶延伸针对环状模板的引物(Fire A and Xu SQ. Rolling replication of short circles. PNAS 92: 4641-4645 (1995);利用环状探针检测靶标的分支扩增(Ramification, Amplificaiton， RAM) (Zhang W, Cohenford M， Lentrichia B, Isenberg HD, Simson E, Li H, Yi J, Zhang DY. Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J Clin Microbiol. 2002 Jan; 40(l):128-32.);以及最近的解旋酶依赖的等温DNA扩增 (Helicase-Dependent isothermal DNA amplification, HDA)， 其禾U用解旋酶 代替加热来使DNA链解开(Vincent M， Xu Y, Kong H. Helicase」dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug; 5(8):795-800.)o最近，已经描述了 DNA的等温扩增法(Walker GT， Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992))。传统的扩增 技术依赖于在扩增反应每一个循环中的耙标分子变性和退火的连续循 环。DNA的热处理导致DNA分子一定程度的剪切，因此当DNA有限， 例如从来自发育中的胚泡的少量细胞中分离DNA时，或者特别是在DNA 已经是片段的形式如在组织切片、石蜡块和古代DNA样品中的的情况 下，这种加热-冷却循环可能进一步破坏DNA并导致扩增信号的丢失。等温法不依赖于模板DNA的连续变性来产生单链分子作为进一步扩增的模板，而是通过特异的限制性内切酶在恒温下酶切DNA分子，或者通 过利用解旋酶解开DNA双链体。术语称为链置换扩增的技术依赖于某些限制性内切酶切割半修饰 DNA的未修饰链的能力以及缺少5'-3'核酸外切酶的DNA聚合酶延伸和 置换下游链的能力。然后通过偶联有义和反义反应而实现指数扩增，其 中来自有义反应的链置换充当反义反应的模板(Walker GT, Little MC， Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396 (1992)。此 类技术已经成功地用于以下扩增结核分枝杆菌(iV^"6"dm'"m 励ercw/簡'"(Walker GT， Little MC， Nadeau JG and Shank D. Isot本文档来自技高网...

【技术保护点】
确定受试者健康状态的测定法，包括：　　　　用能修饰核酸中未甲基化的胞嘧啶的试剂处理受试者样品，其中样品中病毒核酸和基因组核酸经处理形成衍生病毒核酸和衍生基因组核酸；　　　　测定所述处理样品中衍生病毒核酸的存在；以及　　　　确定所述处理样品中所述衍生基因组核酸中基因组靶标的状态，其中一个或多个所述衍生病毒核酸的存在和所述基因组靶标的状态可指示健康状态。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：道格拉斯斯潘塞米勒，约翰R梅尔基，乔治L加博尔米克洛斯，
申请(专利权)人：人类遗传标记控股有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]