一种能够与ＰＫＲ激酶结构域特异性结合的多肽及其应用。本发明专利技术应用噬菌体展示文库技术，筛选能够与ＰＫＲ↓［ｃａｔ］特异性结合的１２肽，其氨基酸序列为：Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ。该１２肽具有与ＰＫＲ↓［ｃａｔ］特异性结合的特性，并且能够抑制其激酶活性。因此，该１２肽对研究ＰＫＲ↓［ｃａｔ］在细胞调亡中作用及ＰＫＲ↓［ｃａｔ］抑制剂的开发具有实用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程与生物医药
，涉及利用噬菌体展示技^1选能与PKR激酶结构 域(PKIU)特异性结合的多月级其应用。 背景駄PKR是一种由干扰素i秀导的,于双链RNA的蛋白激酶，是^+亥翻i^始因子elF2 a激酶家 族成员之一。它是一种有551个氨基酸组成的丝氨酸一苏氨酸激酶，而近其臓究也发现欺有酪 氨酸激酶的活性。结构上， 主要包括2个功能性结构域N端与RNA结合的调节性结构域和C端的催化结构域。PKR在干媳 诱导的抗病毒防御应答中发挥主要的作用，被认为是IFN诱导的最具有特征性的抗病毒路径。PKR也可能是治疗多种神经退行性病变的药物靶标。其中，阿尔茨海默症(AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损 害为主的中枢神经系统退行性疾病，H神经纤维丝缠结和神经细胞死亡，理变化为病理 特征。P —淀粉秀导的神经细胞凋亡中半胱天冬歐a印ase从PKR的A印251切掉PKR的调节结构域，释放出组成型激活的elF2a激酶结构域从而导致神经细胞蛋白合成的抑制。以PKRcat作为靶蛋白，抑制剂可以用于开发延缓M痴呆病中神经细胞的死亡，缓解和治疗^P痴呆的 药物。在过去的10年间，多肽疗法对医药行 说，被认为是一项很有前途的新开发。，范围内 有600—700种多肽正处于开发阶段。其中，在细胞信号ffig各的基lf鹏开究和药物研发方面，激酶多 肽类抑制剂已成为一个非常輸途的领域。例如，多肽PKI抑制PKA的激酶活性I細于研究人淋巴 细胞的调亡通路。豆蔻酰基化蛋白激 歐的抑制肽在细胞水平和动物水平都能够牛寺异的抑制PKC的活性。。 尽管PKR激酶结构^S老 年痴呆等疾病中发挥作用，但目前絲帘KR抑制剂和PKR多肽鄉帝挤啲报道。多肽药物设计中，禾,噬菌体呈现技术构建不同容量的随机肽库，从这些月裤中快速筛选出 活性多肽，并鉴定其结构，可以简便决速地获得与耙好具有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋 白，这翻太段可以作为f離药物进行开发。
技术实现思路
本专利技术目的是,一种育,与PKR激酶结构JI^异性结合的多形汲其应用。 PKR是神经细胞凋亡相，病，如^^痴呆症药物开发的新耙点。本专利技术应用12肽噬菌体展示文库对Pl进行五轮筛选，获得了能与Pl賴异性结合的12肽，并且该12肽宫^1I制PKR^的激酶活性。本专利技术应用噬菌体展示文库对神经细胞凋亡相关蛋白PKRcat进行筛选，获得了一，异性结合PKIU的12肽，其氨基M)^列如下Asp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe國Met-Ala-His-Gln-Thr 。战多肽，该够与PKR激酶结构域特异性结合，并且f,制PKR^磷酸化elF2 a的能力， IC5o约为250nM 。戶诚的多肽可以用于抑制PKILt激酶活性。可以应用于开发PKRcat抑制剂。 本专利技术掛共的与PKR激酶结构域特异性结合的多肽的筛选和鉴定步骤如下*^1^人？^进行五轮筛选，获得与PKR结合的重组噬菌体； ELISA法检测噬菌体与PKR^的结合； 单克隆噬菌体的分离制备； ,体基因组单链DNA的提取和获得寡月，列； 多肽固相合成，竞争ELISA检测多肽与PKH的结合； 应用体外生物化学方法研究12月树PKIU激酶活性的影响。本专利技术的有益皿是本专利技术12肽倉嫩特异性的与PKIU结合^P制Plt的激酶活性，可应 用于Plt抑制剂的药物设计。 附图说明图l.是免疫印迹法(Western Blot)检测纯化PKR^的激酶活性，图2.是噬菌体展示中每轮 的噬菌体数，以空 L作为对照，图3.是ELISA法检测筛选得至啲噬菌体和原噬菌体库与Plt和空孔的结合，图4.是ELISA法检测10个噬菌,克隆与Plt及空孔的结合，图5.是竞争ELISA法检测合成12肽与PKIU的结合，图6.是体外酶学方纟at测合成12月树PKILt激酶活性的影响。实施例l:重组Pl的^J^舰活性的初步研究1. 離Pl质粒的构建利用已有的pET28a-PKR f鎌，下面的PCR弓嫩和Pfu聚合酶PCR扩增PKR^: 正向引物5 ' -CATGCCATGGGCGACATGAAAGAAACAAAGTATACTG-3' 反向弓l物5'-GGCTCTCGAGACATGTGTGTCGTTCATTTTTCTC-3' 禾,Nco I /Xho I消化扩增DNA片段，并且克KA质粒pET28a (Novagen)。将这样构建的 重组质粒命名为pET28a-PKR^并且导入大肠杆菌BL21 。重组质粒pET28a-Plt允许在成熟的Plt 的N彩浠具有另夕卜个甲基硫氨,凝口在C 具有另外6个组氨酸的重组PKIU的皿。2. 魏Pl的纯化① .龄有pET28a-Plt的BL21于5mL LB培养基(50ng/ml卡那霉素)，37°C， 250rpm摇菌过 夜。② .1: 50的比例转接到4个大瓶中(^250mLLB培养基，50 u g/ml卡那霉素)，37°C， 250rpm 摇菌2小时。加入300uMIPTG， 27°C， 250rpm，过夜诱导。③.将诱导过夜的菌液10000rpm，离心15倂中。用Lysis Buffer (20mM Tris-HCl， 500rnM NaCl， pH 7.5)重悬沉淀，10000rpm，离心15射中。 .用40raL Lysis Buffer重悬所有沉淀，加入PMSF蛋白,制剂至终浓度为lraM，在冰浴中超声 破碎(功率300W，超声5s，停15s, 90循环)。 将 液12000rpm， 15射中离心两次。将离心后的上清与4mL Ni树脂4。C结合lh。⑥ .在蛋白与树脂结合的同时,清洗蛋白纯化仪:先用清水清洗B ，，,洗A管置(5mL/辦中)； 再用Elution Buffer (20rnM Tris-HCl， 500rnM NaCl， 250mM咪唑，pH 7. 5)清洗B M (0. 5mL/ 併中)；最后用Lysis Buffer清洗A M (0. 5mL/併中)。⑦ .将结合蛋白的树脂离心，弃上清，装柱，连軒AKTA prime plus蛋白纯化仪(通用电气)。 用Lysis Buffer漂洗Beads,洗下一降寺异结合的蛋白。用Elution Buffer梯度洗脱目的蛋白。⑧ .根据蛋白峰的隨，收集相应管的》m液，跑SDS-聚丙烯翻安 鹏电泳(SDS-PAGE),考马斯 賠她銜正。3. PKRcat激酶活性的初步分析反应体系为40 uL:① .将50ng纯化PKILt加入置于冰上试管中，其终浓度为25nM。② .混合底物纯化的elF2 a ， ATP， 5 X Buffer A (lOOmM Tris-HCl， 200mM KC1， lOmM MgCl2)和 双蒸水使反应液中含终浓度为20mMTris-HCl， 40mMKCl， 2mMMgCl2， 500nMelF2 a ， IOOpMATP， 以此混合液启始反应。③ .以^)混合液启始反应，30。C7K浴准确反应10辦中。力口 8 p L 6XLoading Buffer终止鹏。. 9(TC沸水中煮5射中。样品7转[]至室温，'M离心机短暂离心( 15s)。⑤ .上样，进行SDS—PAGE电泳。⑥ .Western Blot法检测elF2本文档来自技高网...
【技术保护点】
与ＰＫＲ激酶结构域特异性结合的多肽，其氨基酸序列如下：Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹又佳，常云松，张宏恺，张翠竹，杜明娟，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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