山羊颌下腺生物活性物质的提取方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种山羊颌下腺中生物活性物质的提取方法与应用。取山羊颌下腺组织匀浆或冷冻干燥，将匀浆液或含冷冻干燥粉的溶解液离心，将上清液装入层析柱多次层析洗脱，检测出具有生物学活性的洗脱峰，浓缩干燥活性峰即得生物活性物质。山羊颌下腺生物活性物质的特征为对动物结肠炎和慢性萎缩性胃炎等模型有治疗作用，可实现其对各种消化道粘膜的保护作用。本发明专利技术具有提取方法便捷、高效，提取物生物活性强的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化学医药领域，尤其涉及一种山羊颌下腺生物活性物质的提取方法与应用。
技术介绍
消化道腺体，如颌下腺，十二指肠Brunner腺、胰腺体等器官合成并分泌表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)， EGF是一种强有力的细胞分裂促进因子。生理状态下，消化道中EGF的含量较高， 对粘膜有保护作用。EGF 口服治疗胃溃疡的研究表明了其具有显著的粘膜保护作用。EGF对胃溃疡的治疗 作用的机理为增加胃黏膜血流量，促进黏液糖蛋白合成和分泌，促进巯基化合物合成，也与抑制胃酸有 一定关系。Sinha等用EGF灌肠发现其对治疗炎症性结肠炎有明显效果。许多临床使用的胃黏膜保护药物， 如硫糖铝等，是通过刺激内源EGF的分泌来起作用的。1952年，美国科学家Cohen最先从小鼠颌下腺提取了 EGF。国内外，天然与重组的EGF己应用于角 膜、皮肤损伤和胃肠道粘膜愈合的临床试验。EGF的研究开发有重要的应用前景和经济价值。但目前普遍 存在着投资大、收益率低等缺陷。EGF的分离纯化方法有1972年Savage采用酸抽提、BIO-纤维柱和DEAE-纤维柱分离、纯化EGF。 1975年Cohen等从预处理的浓缩尿液中分离EGF:使用Bio-Rex 70柱吸附、Bio-Gel P10柱过滤、 SephadexG-75柱过滤、DE-52、 CM-52柱层析分离、纯化。EGF的在组织中的浓度比较低，需要经过较长 时间的分离和纯化，才能得到比较纯的EGF。已有的工艺比较复杂，纯化成本高。与小鼠相比，山羊颌下腺来源丰富，且不必为了提取EGF而大量饲养小鼠，造成巨大浪费。每只山羊 的颌下腺重约6-10g,在和小鼠颌下腺EGF含量大致相同情况下，分离纯化后得到的产物远远高于小鼠颌 下腺。本专利技术的制作成本低、得率高更适应治疗需求。因此，开发山羊颌下腺中的生物活性作用的EGF类产品，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种山羊颌下腺中生物活性物质的提取方法。 本专利技术的另一目的在于提供一种山羊颌下腺中生物活性物质的应用方法。一种山羊颌下腺中生物活性物质的提取方法包括取山羊颌下腺组织匀浆或冷冻干燥，将匀浆液或含 冷冻干燥粉的溶解液离心，将上清液装入层析柱多次层析洗脱，检测出具有生物学活性的、冼脱峰，浓縮干 燥活性峰即得生物活性物质。作为优选，所述的层析柱为阴离子层析柱、阳离子层析柱、凝胶层析柱中的一种或几种。优选二乙基 氨基乙酯Sphacel (diethylamino ethyl cellulose, DEAE)层析柱、凝胶葡聚糖凝胶G50 (S印hadex)层析柱、 二乙基氨基乙酯52(diethylamino ethyl cellulose, DE)层析柱、羧甲基纤维素层析柱(Carboxymethyl cellulose , CM)等。作为优选，所述的洗脱峰生物学活性检测方法为酶联免疫吸附试验、蛋白电泳试验、WESTERN试验、 MTT法测定细胞增殖试验、测定新生小鼠睁眼时间试验中的一种或几种。山羊颌下腺生物活性物质的特征为对动物结肠炎和慢性萎缩性胃炎等模型有治疗作用，可实现其对各3种消化道粘膜的保护作用。本专利技术具有提取方法便捷、高效，提取物生物活性强的优点。具体实施方式 一、山羊颌下腺生物活性物质的提取以及活性检测1、 组织样品的准备从一8(TC低温冰箱内取新鲜成年浙江白山羊或改良浙江白山羊(l一2周岁)颌下腺4只，分离附着的 组织成分，用眼科剪剪碎，仔细剔除腺体内的血管、神经、结缔组织等，加20ml0.05M醋酸，置于碾钵内 碾碎，再用匀浆器匀浆数次，以上步骤均在4'C冰上操作。匀浆均匀后将匀桨置于离心管中，低温离心机50 000xg， 30min，弃去沉淀，抽取上清液(约10ml)备用。2、 DEAE Sphacel胶梯度洗脱将购置的DEAE Sphacel胶在20%乙醇中搅拌后，静置，倒出上层的乙醇。加入0.02 M醋酸铵，搅 拌均匀，静置。将制备好的胶上柱。达到平衡后，开始上样。本次实验平衡时泵速为1.4ml/min。建立洗脱程序，梯度从100XA液(0.02M醋酸铵)到100XB液(0.2M醋酸铵)，时间为1080 min， 流速为0.4ml/min，收集器设置为9 min 1管。UV—280nm检测图分析，见数个大峰，前面可能是杂蛋白， 故从最大峰后开始共选出相应的94管做ELISA。3、 ELISA法测定山羊颌下腺生物活性物质峰洗脱峰收集的94管做ELISA检测，以0. 2M醋酸铵做阴性对照、购买的rhEGF标准品做为阳性对照。 抗原包被后，封闭非特异结合位点。抗体结合最后测定吸光度，酶标仪450nm处测定黄色吸光度。表DEAE柱层析后活性峰ELISA测定OD值<table>table see original document page 4</column></row><table>*与对照组(0.2 M醋酸铵)比较P < 0.01， △与EGF标准品组比较P < 0.01活性峰浓縮液的活性接近EGF标准品。4、 透析浓縮ELISA结果显示，层析图中，峰2与峰3之间有10余管的读数较高，显示这几处可能有EGF活性组 份(读数高、和EGF标准品读数接近为有EGF活性组份的可能)。将与标准品EGF吸光度值接近的这些 组份收集在一起，将这些组份合并后进行透析(透析袋分子量为3500)，透析过夜，透析过程在4'C冰箱 中进行。脱去盐分，将透析好的组分分别用甘油(丙三醇)或聚乙二醇(分子量20 000)进行浓缩，除去 水分。将合并后的组份浓縮到lOml.左右。将透析浓縮后的组份再次进行ELISA实验，过程同上所述，只 是分别取透析浓縮后的组份及0. 2 M醋酸铵和rhEGF标准品共五孔进行实验。ELISA实验结果表明，透析浓縮后组份的OD值与EGF标准品的OD值相近。5、 Sephadex G50胶洗脱6 g Sephadex G50干胶，加入100ml超纯水，溶胀2—5小时。平衡后，静置。上柱，平衡流速，然 后将过DEAE Sphacel柱并且透析、浓縮、经ELISA检验有活性的组份用滴管慢慢地加入层析柱上样。建立洗脱程序，时间为1080min，流速0.8 ml/min，收集器每9分钟收集1管，共120管。洗脱液为超纯水。 在洗脱的同时开启记录软件记录280 nm OD值及电导。洗脱峰收集的各管组份做ELISA检测，以高纯水做阴性对照、购买的rhEGF标准品做为阳性对照。 步骤同上，简述如下抗原包被—2%脱脂奶粉封闭—结合一抗—结合二抗—与底物作用—酶标仪在652 nm 处OD值。加1.5M硫酸中止液后其在450nm的OD值。16， 17， 18， 19， 20号管与层析图中的一个洗 脱峰正好相对应，因此该峰即为活性峰。表羊颌下腺EGF活性洗脱峰的OD值<table>table see original document page 5</column></row><table>*与对照组(高纯水)比较P〈0.01，A与EGF标准品组比较P〈0.05活性峰浓缩液的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山羊颌下腺中生物活性物质的提取方法，其特征在于包括如下步骤：（１）、取山羊颌下腺组织匀浆或冷冻干燥，将匀浆液或含冷冻干燥粉的溶解液离心，取上清；（２）、将上清液装入层析柱进行层析洗脱，并检测具有生物学活性的洗脱峰；（３）、合并活性峰 并浓缩；（４）、浓缩液过层析柱，洗脱液经生物学活性检验后，浓缩干燥活性峰即得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姒健敏，王良静，赵晓燕，袁庆丰，陈淑洁，徐立红，翁登坡，
申请(专利权)人：浙江大学，杭州博通胃肠病诊治技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]