本发明专利技术公开了可溶性淀粉共振散射光谱法检测α－淀粉酶活力的方法，它是利用已知酶活力的α－淀粉酶的共振散射强度Ｉ↓［４２３ｎｍ］和试剂空白的共振散射强度Ｉ↓［０］，求出ΔＩ↓［４２３ｎｍ］＝Ｉ↓［４２３ｎｍ］－Ｉ↓［０］做标准曲线，然后测定未知浓度的α－淀粉酶的ΔＩ，依据工作曲线求得被测物的α－淀粉酶的浓度，本发明专利技术的优点是：设备简单、操作方便，只需要荧光分光光度计即可完成；试剂易得，成本低廉；底物可溶性淀粉无毒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及or淀粉酶活力的检测方法，具体是可溶性淀粉共振散射光谱法检测a-淀粉 酶活力的方法。技术背景-a-淀粉酶(a-Amylase, AMS)的全称为1， 4-a_D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(EC 3. 2. 1. 1)， 是一种不均一性的钙依赖金属蛋白质酶，它作用于淀粉的a-1,4葡萄糖苷键，生成麦芽糖和 葡萄糖。它己经广泛用于食品、发酵、谷物加工、纺织、造纸、医药、轻化工业、石油开采 等各个领域。在临床上有很高的应用价值，根据体内酶活力的变化诊断疾病，如胰脏疾病和 肾脏疾病导致淀粉酶活力升高；肝脏疾病可导致酶活力下降。因此对a-淀粉酶的研究具有重 要的意义。目前对于or淀粉酶的检测，有流动注射光度法、微量量热法、粘度测定法、碘量 法、凝胶扩散法3.5二硝基水杨酸法等。其中流动注射光度法的线性范围为0. 1-3mmol七—'， 灵敏度较低。粘度测定法因精确性差，底物不稳定很少采用。微量量热法虽然相对较简单， 但不够准确。检测cr淀粉酶活力的方法虽然很多，但可溶性淀粉共振散射光谱法检测or淀粉 酶活力的方法，尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是要公开一种灵敏度高，简便快速的可溶性淀粉共振散射光谱法检测a-淀 粉酶活力的方法。溶性淀粉共振散射光谱法检测a-淀粉酶活力的方法包括如下步骤一、 制备已知a-淀粉酶活力的测试体系1、 在5 mL具塞刻度试管中，分别加入0.65ml 10mg/mL可溶性淀粉和pH 5.3 Na異-K跳溶液，然后再加入0. lOmL 0. 27。CaAcv溶液和0. lml 0. 9%Nacl溶液，将试管置 水浴锅中，5(TC预热，放置5min;2、 然后再加入适量5Mg/mLa-淀粉酶溶液，摇均时开始计时，放回5(TC水浴锅中温浴， 放置85min;3、 然后再依次加入0.40 mol/L 0. 2ml NaOH溶液，用二次蒸馏水定容至3ml，摇匀；4、 用荧光光度计同步扫描得到体系的共振散射光谱，淀粉微粒在264nm和423nm处有 两个较宽的散射峰，在423nm处测定体系的共振散射强度I423nm;二、 制备试剂空白体系用步骤一的方法制备试剂空白体系，但不加入a-淀粉酶溶液，用荧光分光光度计测得试 剂空白体系共振散射强度Io;三、 计算Ai42h-l423訓-I()的值；四、 以加入的or淀粉酶浓度为横坐标，以A^^为纵坐标，绘制工作曲线；五、 依据步骤一的方法，制备检测体系，加入的a-淀粉酶为未知浓度的检测样品，求得3被测样品的A/;六、根据工作曲线，求得被测样品中a-淀粉酶的浓度。实验表明，在未加入a-淀粉酶之前，可溶性淀粉体系的同步散射光谱较强(图1)，当 有or淀粉酶存在时，体系的同步散射有所减弱，随着浓度的增加，共振散射强度也逐渐降低， 并且，a-淀粉酶的浓度在0.00835—0.50lPg/ml范围内，a-淀粉酶的浓度与共振散射强度呈 良好的线性关系，线性方程为1=4. 96C+3. 8 。检测限为0. 0069Pg /ml。本专利技术的原理可溶性淀粉具有很强共振散射效应，a-淀粉酶水解可溶性淀粉成小颗粒的淀粉微粒，共 振散射强度降低。共振散射强度降低的大小与a-淀粉酶的浓度呈正比关系，将可溶性淀粉微 粒的共振散射光谱检测与a-淀粉酶的催化反应相结合，建立起可溶性淀粉共振散射光谱法检 测a-淀粉酶活力的方法。本专利技术的优点(1) 设备简单、操作方便，只需要荧光分光光度计即可完成；(2) 试剂易得，成本低廉；(3) 底物可溶性淀粉无毒。附图说明图1为本专利技术实施过可溶性淀粉体系的共振散射光谱图；图中a:pH5. 3- 2. 6mg/ml starch-0. 36 mg/mlNacl-O. 08 mg/ral CaAc2-0. 04mol/L NaOH b: pH5. 3-2. 6mg/ml starch-O. 36 mg/mlNacl-O. 08 mg/ml CaAc厂O. 04lVml AMS-0. 04mol/L NaOH c:pH5.3- 2.6mg/ml starch-0.36 rag/mlNacl-0.08 mg/ml CaAc厂O. 16Pg/ml AMS-0. 04mol/L NaOH d: pH5. 3-2. 6mg/ml starch-0.36 mg/mlNacl-0. 08 mg/mlCaAc厂O. 48^g/ml AMS-0. 04mol/L NaOH 具体实施例方式用本专利技术的方法检测20个人的唾液的a-淀粉酶的含量1、 所用试剂的仪器Cary Eclipse分光光度计(Varian Company, Palo Alto, CA)、 HH-S2电热恒温水浴锅(金 坛市大地自动化仪器厂)、TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；可溶性淀粉(中国医药集团上海化学试剂公司)，a-淀粉酶(165， OOOU/g丰特斯化学试 剂公司)，聚丙烯酰胺(分子量在500万以上，上海化学试剂采购供应站分装厂)；可溶性淀 粉溶液取可溶性淀粉0. 25g于小烧杯中，加入约5mL水混匀，将其边搅拌边缓慢倒盛有20ml 沸水的50ml烧杯中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移到50ml的烧杯中，继续搅拌并加 热，缓慢煮沸2min，冷却至30。C以下，加入10mg/mL PAM，用蒸馏水定容至50ml。缓冲溶液 取0.2387g Na2HP(V12H20，加水溶解后定容至100ml 。取0. 0908g KH2P04加水溶解后定容至 lOOml。将此二者按体积比配制成pH Na2HP04_ 1(}^04缓冲溶液，置冰箱保存。所用试剂为分 析纯，所用水均为二次蒸馏水；2、 制备已知cr淀粉酶浓度的测试体系-在5ral具塞试管中，依次加入0. 65ml lOmg/mL可溶性淀粉，0. 70mL pH 5. 3 Na2HP04-KH2P04 溶液，0. 10mL 0. 27。CaA(V溶液和0. lml 0. 9%NaCl溶液，将试管置水浴锅中，50。C预热，5min 后取出，加入适量5^/mLa-淀粉酶溶液，摇均时开始计时，放回5(TC水浴锅中温浴，85min 后取出，依次加入0.40 mol/L 0.2ml NaOH溶液，用二次蒸馏水定容至3ml，摇匀。取适量 于石英池中，置于荧光分光光度计上。电压400V，狭缝为5nm，同步扫描激发波长"x和发射 波长人》 (入。x = 、J得到体系的RS光谱。在423ran处测定体系的散射光强度/,2"3、 用上述2的方法制备试剂空白体系，测的共振散射强度Io;4、 计算A厶23^l4^-Io的值，并做标准曲线在最佳实验条件下,取不同浓度AMS标准液，按实验方法进行测定，并以其共振散射强 度A;与AMS浓度C作图。AMS在0. 00835—0. 501^g/ral (0. 00138-0. 0827U/ml)范围内 与A厶^之间呈现良好的线性关系。其线性回归方程为A/=155C+13，相关系数R-0.9857， 检测限为0.0069l^g /ml;5、 分别取20个人的唾液各lml， 10000rps离心30rain，收集上清液，加蒸馏水稀释100 倍，分别制成测试体系，求20个样品的A/，依据工作曲本文档来自技高网...
【技术保护点】
可溶性淀粉共振散射光谱法检测α－淀粉酶活力的方法，其特征是：测定方法包括如下步骤：１）制备已知α－淀粉酶活力的测试体系：（１）在５ｍＬ具塞刻度试管中，分别加入０．６５ｍｌ １０ｍｇ／ｍＬ可溶性淀粉和ｐＨ ５．３Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］－ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］溶液，然后再加入０．１０ｍＬ ０．２％ＣａＡｃ↓［２］溶液和０．１ｍｌ ０．９％Ｎａｃｌ溶液，将试管置水浴锅中，５０℃预热，放置５ｍｉｎ；（２）然后再加入适量５μｇ／ｍＬ α－淀粉酶溶液，摇均时开始计时，放回５０℃水 浴锅中温浴，放置８５ｍｉｎ；（３）然后再依次加入０．４０ｍｏｌ／Ｌ ０．２ｍｌ ＮａＯＨ溶液，用二次蒸馏水定容至３ｍｌ，摇匀；（４）用荧光光度计同步扫描得到体系的共振散射光谱，淀粉微粒在２６４ｎｍ和４２３ｎｍ处有两个较宽的散射峰，在４２ ３ｎｍ处测定体系的共振散射强度Ｉ↓［４２３ｎｍ］；２）制备试剂空白体系：用步骤一的方法制备试剂空白体系，但不加入α－淀粉酶溶液，用荧光分光光度计测得试剂空白体系共振散射强度Ｉ↓［０］；３）计算Δ↓［４２３ｎｍ］＝Ｉ↓［４２３ｎｍ］－Ｉ↓ ［０］的值；４）以加入的α－淀粉酶浓度为横坐标，以ΔＩ↓［４２３ｎｍ］为纵坐标，绘制工作曲线；５）依据步骤（１）的方法，制备检测体系，加入的α－淀粉酶为未知浓度的检测样品，求得被测样品的ΔＩ；６）根据工作曲线，求得被测样品中α－淀粉酶 的浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马纪，刘庆业，蒋治良，
申请(专利权)人：广西师范大学，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]
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